熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。

　　熒光分光光度計(jì)工作參數(shù)條件的選擇

　　1.激發(fā)波長(zhǎng)的選擇

　　該怎么確定激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)呢?對(duì)許多儀器初學(xué)者來(lái)說(shuō)，這是個(gè)令人感到困擾的問(wèn)題。如果儀器有三維掃描功能，那就比較簡(jiǎn)單，放樣品進(jìn)去，按照說(shuō)明書(shū)要求做三維熒光掃描，可以很方便地確定出合適的激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)。如果儀器沒(méi)有三維掃描功能，一般的方法如下。

　　首先，將儀器的激發(fā)波長(zhǎng)(λem)先設(shè)定為200nm，然后進(jìn)行發(fā)射(EM)模式掃描，發(fā)射波長(zhǎng)(λem)掃描范圍暫設(shè)定為210～800nm，記錄所有出現(xiàn)的峰值波長(zhǎng)；改變激發(fā)波長(zhǎng)(λem)后再掃描，如第二次發(fā)射圖譜中的某個(gè)(或某些)峰的位置沒(méi)有位移(或位移很少)，一般來(lái)說(shuō)這個(gè)(或這些)峰就是熒光峰；因?yàn)闊晒夥宓奈恢檬遣浑S激發(fā)波長(zhǎng)的改變而改變的，僅是峰高(或峰面積)發(fā)生改變。

　　然后，將確定的熒光峰的波長(zhǎng)作為發(fā)射波長(zhǎng)(λem)固定下來(lái)，再做激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)的掃描，激發(fā)波長(zhǎng)的范圍要小于發(fā)射波長(zhǎng)；如果僅出一個(gè)激發(fā)峰則很簡(jiǎn)單確立下來(lái)，再將這個(gè)波長(zhǎng)固定下來(lái)重新做真正的發(fā)射波長(zhǎng)(EM)掃描，可以得到具有良好信噪比的結(jié)果；如果做激發(fā)波長(zhǎng)(EX)掃描后出現(xiàn)幾個(gè)峰，則根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)選擇，一般應(yīng)選擇峰形、高度適合且有一定帶寬的峰作為激發(fā)波長(zhǎng)。也可以參考熒光光譜的特性——激發(fā)光譜與發(fā)射光譜呈鏡像的特點(diǎn)來(lái)確定激發(fā)波長(zhǎng)。

　　2.濾光片的選擇

　　在進(jìn)行發(fā)射圖譜掃描分析時(shí)，根據(jù)斯托克斯定律，設(shè)置的激發(fā)波長(zhǎng)要比發(fā)射波長(zhǎng)短，例如，激發(fā)波長(zhǎng)λex=260nm，則發(fā)射起始波長(zhǎng)應(yīng)該從大于260nm的波長(zhǎng)開(kāi)始，比如270nm，發(fā)射結(jié)束波長(zhǎng)為870nm。這樣一來(lái)，在激發(fā)光的2倍波長(zhǎng)(520nm)、3倍波長(zhǎng)(780nm)處都會(huì)出現(xiàn)激發(fā)波長(zhǎng)的尖銳的倍頻峰，若與熒光光譜峰重疊，將會(huì)對(duì)測(cè)試產(chǎn)生干擾，需選用合適的濾光片將其濾掉。

　　倍頻峰就是激發(fā)光的散射峰，雖然波長(zhǎng)掃描到雙倍波長(zhǎng)的時(shí)候出現(xiàn)，但實(shí)際波長(zhǎng)卻是激發(fā)波長(zhǎng)，可以通過(guò)增加高通濾光片來(lái)去除倍頻峰。高通濾光片一般放在發(fā)射處，片上都標(biāo)明其可以濾除的大波長(zhǎng)。也就是說(shuō)，體系中增加高通濾光片后，比其上所標(biāo)波長(zhǎng)低的光，也包括這些光的二倍波長(zhǎng)光、三倍波長(zhǎng)光，會(huì)被濾掉；而比其所標(biāo)波長(zhǎng)高的光則可以順利通過(guò)。

　　3.狹縫的設(shè)置

　　熒光強(qiáng)度跟很多因素有關(guān)，如分子結(jié)構(gòu)、存在狀態(tài)、溶液濃度或薄膜厚度、溫度、選擇的激發(fā)波長(zhǎng)、測(cè)試狹縫寬度等因素。熒光強(qiáng)度在不同儀器上的測(cè)量值存在較大差異，不具有可比性，但是其峰位還是較容易確定的，可以用來(lái)判斷何種物質(zhì)。進(jìn)行熒光定量分析，必須固定一些條件。

　　狹縫的大小對(duì)熒光強(qiáng)度很重要，狹縫大小可根據(jù)你所測(cè)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度大小作出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在同一濃度，如熒光強(qiáng)度過(guò)大，超過(guò)儀器量程，可減小狹縫。但是，需要指出的是，不能僅憑狹縫的大小來(lái)改變熒光強(qiáng)度，還要考慮分辨率的問(wèn)題。對(duì)于熒光掃描而言，狹縫加大可以使熒光強(qiáng)度提高同時(shí)重現(xiàn)性得到提高，但是分辨率隨之降低。狹縫決定分辨率，儀器其它結(jié)構(gòu)已經(jīng)固定(光柵的刻線數(shù)、焦距以及綜合的線色散系數(shù))，狹縫大小就決定分辨率的高低。對(duì)于實(shí)際使用，狹縫大小需要和測(cè)定的峰的半峰寬相匹配，過(guò)大，峰就變形了。狹縫大小也決定了光通量大小。按照經(jīng)驗(yàn)數(shù)值，狹縫開(kāi)大1倍，光通量將增大4倍。

　　4.步長(zhǎng)的設(shè)置

　　測(cè)量的步長(zhǎng)小，測(cè)量會(huì)慢些，好處足圖譜細(xì)膩些；步長(zhǎng)大，測(cè)量速度快，譜圖就顯得粗糙些。步長(zhǎng)設(shè)置應(yīng)該小于需要測(cè)量小半峰寬的1/5，因?yàn)椴介L(zhǎng)會(huì)與分辨率相關(guān)的。原則上，步長(zhǎng)應(yīng)小于3倍的狹縫寬度。