引言 ：藍藻，又名藍綠藻或藍細菌。一般認為，藍藻是地球 上早進行光合放氧的生物。藍藻可以進行光合作用，與 高等植物葉綠素具有一定程度上的同源性，加上其研究體 系簡單，長期以來一直是研究光合作用的模式生物。除此 之外，藍藻還可以進行固氮作用，將大氣中的氮氣經(jīng)固氮 作用轉(zhuǎn)化為可以利用的氮源，用于提高土壤的肥力。隨著 人們對于光合作用認識的加深，以及對自身生活環(huán)境狀況 的重視，加上藍藻遺傳體系簡單、生長速度快、培養(yǎng)方便 等，相關(guān)方面的研究已經(jīng)引起越來越多的重視，藍藻已經(jīng) 成為一種重要的生理生化應(yīng)用研究模式生物。由于藍藻具 有高光效、生長速度快、遺傳操作體系相對成熟，適用大 通量的基因工程改造等一系列傳統(tǒng)優(yōu)勢，因此，如果可以 通過代謝工程改造藍細菌生產(chǎn)蔗糖并提供給大腸桿菌等微 生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料，必將加速整個生物燃料的產(chǎn)業(yè)化 進程，具有顯著的意義。我們通過此種方法測定藍藻發(fā)酵 液中的一些成分，如蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、葡萄 糖甘油酯、甘露糖、果糖等，有利于了解其基因改造效 果，對于充分利用藍藻意義重大。 本實驗采用離子色譜質(zhì)譜聯(lián)法分離測定7種糖，分離 度好，靈敏度高，操作簡便，建立了一種有效檢測藍藻發(fā) 酵液中游離糖的方法。
測試條件： 儀器：ICS-4000色譜儀（Thermofisher公司），配四 元梯度泵，AS-AP自動進樣器, MSQ單四極質(zhì)譜（ESI源） 色譜柱：CarboPac PA 20 保護柱6.5 µm, 35×0.4 mm，( P/N: 072073) CarboPac PA 20 分離柱6.5 µm, 150×0.4 mm，( P/N: 072072) 柱溫：30℃； 淋洗液：KOH等度淋洗流速：10 µL /min； 定量環(huán)：0.4 µL； 檢測方式：質(zhì)譜檢測（正離子模式加鈉峰） 質(zhì)譜條件：柱后加液NaAC (1 mmol/L) : 乙腈(50 :5 0)， 流速20 µL/min
樣品前處理 取發(fā)酵液樣品，于離心機中離心20分鐘(3000 rpm)， 上清液稀釋適當倍數(shù)后，過RP柱和0.22 µm尼龍濾膜過 濾，取續(xù)濾液直接上機分析。 結(jié)果和討論 色譜柱的選擇及淋洗液梯度條件優(yōu)化 在常規(guī)離子色譜上CarboPac PA 20的糖柱上采用 NaOH/NaOAc梯度淋洗的方式，能夠?qū)⑸鲜?種糖*分 離，且色譜行為良好，在ICS 4000單泵條件下，也可利 用KOH梯度將上述幾種糖分離，但其分析和平衡時間較 長。在質(zhì)譜條件下可利用分子量的不同，選擇不同的離子通道對7種糖進行定性和定量。為了保證色譜峰的分離度 和保留時間的合理性，我們選擇CarboPac PA 20的糖柱 和KOH等度淋洗的方式。 在上述色譜條件下7種糖的色譜 圖如下圖（圖1. 總離子流圖，圖2. SIM圖）。
線性和靈敏度 將標準品定量混合，并將標準品溶液稀釋得到一濃度 系列，對上述系列濃度各測定，以峰面積為縱坐標，標準 液質(zhì)量濃度為橫坐標建立標準工作曲線，以葡萄糖甘油酯 為例，其在0.02 mg/L 10 mg/L范圍內(nèi)線性良好，其回歸 方程、相關(guān)系數(shù)如表1所示。
結(jié)論： 離子色譜分離脈沖安培檢測器測定糖分離度好靈敏度 高，在糖類物質(zhì)的研究中應(yīng)用非常廣泛。毛細管離子色譜 常用色譜柱直徑為0.4 mm，流速為10 µL/min，其進樣體 積通常為0.4 µL，與常規(guī)分析型離子色譜相比，其靈敏度 是常規(guī)離子色譜的近百倍，且。毛細管離子色譜的流速 是10 µL/min，符合質(zhì)譜對低流速的需求；且經(jīng)過抑制器 后，淋洗液中的鉀離子被交換到廢液中，進入質(zhì)譜的流動 相基本為水，與質(zhì)譜具有很好的兼容性，在需要進行定性 研究時可連接質(zhì)譜。并且在進入質(zhì)譜前，可以通過一個三 通引入部分乙腈以增加質(zhì)譜的霧化效率，增加儀器的穩(wěn)定 性。本方法在柱后乙腈溶液中添加了少量乙酸鈉，以提高 糖在質(zhì)譜中的重現(xiàn)性。毛細管離子色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定糖方 法操作簡便，重復(fù)性好，線性范圍內(nèi)相關(guān)性好，準確度 高，進一步拓展了毛細管離子色譜的應(yīng)用范圍，具有較高 的實用價值。
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