Gyrolab平臺采用自動化進樣方式在微流控CD上進行小型化免疫檢測。CD微結構中填裝鏈霉親和素包被的親和微珠，通過生物素化捕獲試劑與分析物特異性相結合，再與熒光標記的檢測試劑結合，通過激光激發(fā)親和柱上的熒光信號并用檢測器對熒光信號進行讀數(shù)。Gyrolab免疫測定法具有自動化、通量高、節(jié)省時間、試劑與樣品用量少、動態(tài)范圍廣和基質效應低等優(yōu)勢，已在生物藥物研發(fā)和生產(chǎn)領域得到廣泛應用。
Gyrolab采用均相橋聯(lián)格式 (homogenous bridgingformat) 檢測ADA， 藥物分子同時用作捕獲試劑 (生物素化) 和檢測試劑 (Alexa Fluor® 647熒光標記) ，樣品和試劑混合后再加入CD 微結構的鏈霉親和素柱中，然后檢測 ADA 或陽性對照在生物素化的藥物分子和熒光團標記的藥物分子之間形成橋接復合物 。這種檢測形式可檢測所有同種型的 ADA (IgG、IgM、IgA 等) 且不依賴于物種，既可用于臨床前也可用于臨床研究。
Gyrolab平臺提供ADA檢測的完整解決方法，簡化從篩選試驗到確證試驗開發(fā)的工作流程，包括ADA分析軟件模塊、Rexxip ADA樣品稀釋緩沖液和兩種不同格式的CD。
Gyrolab Mixing CD 96是專用于酸解法檢測ADA的微流控CD，它將樣品酸解離預處理步驟整合到自動化檢測流程中。每片Mixing CD上有96個微結構，每個微結構中均有一個樣品混合室可用于樣品孵育和酸解離。進行ADA檢測時，首先將樣品加入微結構中的體積定義通道，200 nL樣品在CD離心力作用下進入混合室，接著加入酸性緩沖液到混合室中，ADA-藥物復合物可在低 pH 環(huán)境中解離。然后將含有捕獲試劑和檢測試劑的 Master Mix中和緩沖液中加入混合室，ADA分子與標記試劑接觸并形成新的 ADA 復合物。這樣使標記試劑與未標記游離藥物的比例有利于形成可檢測的標記試劑-ADA橋接復合物，最后將復合物捕獲到鏈霉親和素包被的微珠上，并通過激光誘導熒光檢測器進行檢測。這一檢測流程實現(xiàn)了從樣品試劑添加、在線酸解離再到信號檢測的全自動化，自動化程序精確控制每個步驟的時間和反應體積，最大限度地減少了動手操作，不僅顯著提高了檢測精確度，而且大幅縮短了分析時間。
Gyrolab支持兩種不同的樣品預處理方式來克服游離藥物對ADA檢測的干擾，可根據(jù)藥物特性和應用情況靈活選擇適用的方法。使用Gyrolab技術進行ADA檢測的主要優(yōu)勢包括：
納升級的反應體系，試劑和樣品用量少
自動在線酸解離，提高檢測精密度
親和柱流穿技術將基質效應最小化，提高檢測靈敏度和藥物耐受性
親和柱高載量更有利于高濃度的標記試劑與游離藥物競爭，通過計量優(yōu)勢進一步提高藥物耐受性
分析速度快，每片CD的運行時間約1小時，采用Mixing CD 96在線酸解離檢測運行時間約2小時
動手操作少，減少人為誤差
專用ADA軟件模塊按照監(jiān)管標準指導篩選試驗和確證試驗開發(fā)流程
免疫原性檢測方法的關鍵參數(shù)包括檢測靈敏度、藥物耐受性和選擇性。藥物耐受性是指在殘留治療藥物的情況下檢測抗藥物抗體 (ADA) 的能力, 評估游離藥物與ADA的結合情況是為了避免出現(xiàn)假陰性的風險。選擇性是指在正?；|或疾病基質的情況下評估檢測的穩(wěn)健性，對于確保臨床研究中評估不同樣本時的一致性至關重要。另外，在使用橋聯(lián)法進行ADA檢測時的一大挑戰(zhàn)是靶點的干擾，臨床樣本中存在的二聚體或多聚體形式的可溶性靶點可能會導致假陽性結果。
Novimmune SA公司研究人員在開發(fā)針對一種治療性抗體藥物 (Novimab) 的ADA檢測方法的過程中，采用Gyrolab和ECL (Electochemiluminescence, ECL) 技術對不同方式處理的樣品進行了檢測 (靶點耗竭樣品、非靶點耗竭樣品、酸化樣品和非酸化樣品) ，并對兩種檢測方法的關鍵參數(shù)例如靈敏度、藥物耐受性和靶點耐受性進行了評估和比較，以獲得符合目的 (Fit-for-purpose) 的臨床免疫原性檢測方法[1]。
研究人員使用生物素化的藥物作為捕獲試劑，Alexa Fluor® 647標記 (Gyrolab) 或Sulfo-tag標記 (ECL) 的藥物作為捕獲試劑，純化的多克隆兔抗藥物抗體作為ADA陽性參照物，在兩個平臺上以均相橋聯(lián)格式進行ADA檢測。Gyrolab平臺使用Bioaffy 200 CD進行非酸化樣品檢測，Mixing CD 96進行酸化樣品檢測，樣品酸解離和中和在Mixing CD上自動完成。
在三天里對一個陰性對照樣品(NC) 和九個陽性對照樣品 (PC , 2、5、20、50、100、250、500、1000 和 10000 ng/mL ADA) 進行檢測，根據(jù) 3 次檢測間運行的結果確定靈敏度，即持續(xù)返回高于閾值信號的z低 PC 濃度。
兩種方法的靈敏度都很高，低于100 ng/mL。對于非酸化樣品檢測，Gyrolab和ECL平臺的靈敏度均為2 ng/mL；對于采用酸解離步驟的樣品，Gyrolab檢測的靈敏度為5 ng/mL, 高于ECL的20 ng/mL的靈敏度。
在非酸解和酸解離條件下，Gyrolab和ECL平臺對PC樣品檢測的信號值。X軸為ADA參照物濃度，Y軸為信噪比 (PC 信號均值除以 NC 信號均值)
在兩個平臺上使用經(jīng)優(yōu)化后的最佳條件，分別對酸化和非酸化樣品的檢測進行了比較研究：在含有 0、20 和 100 µg/mL單抗藥物的情況下，對九種 PC 樣品 (5、20、50、100、250、500、1000、2500 和 10000 ng/mL ADA) 進行了檢測，數(shù)據(jù)顯示Gyrolab 平臺顯示出更高的藥物耐受性。對于未經(jīng)酸化的樣品檢測，在 20 µg/mL和 100 µg/mL的藥物濃度下，Gyrolab可分別檢測到 100 ng/mL 和 500 ng/mL 的 ADA，ECL平臺可分別檢測到 250 ng/mL 和 1000 ng/mL 。對于酸解離樣品檢測，在藥物濃度為20 µg/mL時，Gyrolab可檢測到5 ng/mL ADA, ECL平臺為50 ng/mL；當藥物濃度水平提高到100 µg/mL時，兩種平臺的檢測靈敏度均為50 ng/mL ADA。
在藥物水平為0, 20和100 µg/mL的條件下，兩種平臺的檢測靈敏度。靈敏度定義為超過閾值信號的z低PC濃度。
在本研究中，可溶性靶點可能形成二聚體干擾檢測造成假陽性結果，而且在疾病人群中，可溶性二聚體靶點的基礎水平可能遠遠高于健康人血清中測得的水平，所以提高檢測方法的靶點耐受性對于臨床分析非常重要。
為了評估靶點耗竭步驟的效率，將含有四種不同濃度可溶性二聚體靶點 (5、20、50 和 200 ng/mL) 的樣品分成兩組，一組進行靶點耗竭前處理，另一組則不做靶點耗竭，然后分別在兩個平臺上進行有/無酸解離步驟的檢測。數(shù)據(jù)顯示，在沒有酸解離的情況下，Gyrolab和ECL檢測都只能耐受5 ng/mL 的可溶性二聚體靶點；通過將靶點耗竭和酸解離步驟結合，兩個平臺的靶點耐受水平都提高到了200 ng/mL。
在無酸解離或無靶點耗竭步驟條件下，評估兩個平臺在不同可溶性二聚體靶點濃度下的耐受性。虛線所代表的閾值固定為信噪比1.25。
兩個平臺在不同可溶性二聚體靶點濃度下的檢測結果，符號 "+"和"-"分別表示樣本信號高于或低于閾值。
使用僅含有游離ADA的樣本進行了檢測間精密度評估，包括酸解離樣品和未經(jīng)酸解離樣品的檢測。在不同日期使用ECL平臺對九種不同濃度的 PC (2、5、20、50、100、250、500、1000 和 10000 ng/mL) 進行3次獨立檢測，使用Gyrolab平臺對五種不同濃度的PC (5、20、100、500 和 10000 ng/mL) 進行5次獨立檢測，根據(jù)每種 PC 水平獲得的信號值計算運行間精密度 (CV%)。數(shù)據(jù)顯示，在沒有酸解離步驟的情況下，Gyrolab和ECL檢測的精密度都很高，所有 PC 樣品的CV均低于 10%；但在酸解離檢測中，明顯觀察到ECL檢測的CV從10%增加到 26%，而Gyrolab檢測依然保持了良好的精密度，除5 ng/mL PC樣品外，其他樣品檢測的CV均低于10%。這是因為Gyrolab技術采用全自動化酸解離處理，減少了人工操作和誤差，從而降低了結果的變異性。
檢測間精密度，“NT" 表示未進行檢測，“<blq"< span="">表示低于方法檢測靈敏度。
本研究數(shù)據(jù)顯示，Gyrolab和 ECL技術在ADA檢測的靈敏度、藥物耐受性、靶點耐受性和精密度等參數(shù)方面均表現(xiàn)出良好的性能，兩種檢測方法都適用于方法驗證和臨床樣本分析
對采用酸解離步驟的樣品檢測，Gyrolab具有更高的檢測靈敏度和藥物耐受性
Gyrolab平臺集成全自動樣品酸解離，減少了動手操作和誤差，提高了檢測間的結果重復性
Gyrolab檢測所需的試劑量更少，檢測運行時間更短，通量更高
參考文獻：
[1] Collet-Brose J, Couble PJ, Deehan MR, Nelson RJ, Ferlin WG, Lory S. Evaluation of Multiple Immunoassay Technology Platforms to Select the Anti-Drug Antibody Assay Exhibiting the Most Appropriate Drug and Target Tolerance. J Immunol Res. 2016;2016:5069678. doi: 10.1155/2016/5069678. Epub 2016 May 3. PMID: 27243038; PMCID: PMC4868908.
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