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郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

閱讀：476 發(fā)布時(shí)間：2024-7-27

郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

郁金香碎色病毒
探針法熒光定量 RT- PCR 試劑盒
Tu lip b reaki ng Pot y vi rus P ro be RT - q P C R K it產(chǎn)品及特點(diǎn)

本試劑盒可用于檢測(cè)郁金香碎色病毒。郁金香碎色病毒（Tulip breaking Potyvirus ， TBV）屬馬鈴薯 Y 病毒科馬鈴薯 Y 病毒屬，只侵染郁金香屬(Tulipa spp.)和百合屬(Lilium spp.)植物，導(dǎo)致郁金香和百合的花瓣和葉片出現(xiàn)斑駁的雜色條紋，感染 TBV 的郁金香不僅表現(xiàn)出花色雜色，而且植株也會(huì)退化。本產(chǎn)品是根據(jù)探針法熒光定量 RT-PCR 原理開發(fā) 的郁金香碎色病毒檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1.   即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2.   引物等組分經(jīng)過優(yōu)化，靈敏度高。
3.   提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.   特異性高，引物是根據(jù)郁金香碎色病毒 RNA 序列高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.   既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè) 數(shù)量級(jí)。
6.   本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
7.   本產(chǎn)品只能用于科研。

成分規(guī)格

產(chǎn)品組成	編號(hào)	規(guī)格
2 × OneStep Probe Mix	021101a	550 μl
OneStep Probe Enzyme Mix	021102b	55 μl
DEPC-H2O	070401	1 ml
熒光模板稀釋液	070407	1 ml
郁金香碎色病毒 RT-qPCR 引物-探針混合液	1525190yp	210 μl
郁金香碎色病毒 RT-qPCR 陽性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL)	1525190pc	50 μl

保存條件

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對(duì)照需要單獨(dú)放置，不要污染其他試劑。
郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
使用方法
一、RNA 提取(樣本制備區(qū))
用自選方法提取純化樣品 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。建議使用病毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒（Cat:GZ010702-50）提取 RNA。
二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))
（由于陽性對(duì)照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，避免污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1.    標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2.    用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光模板稀釋液，（最好用帶芯槍頭，下同）。
3.    在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.    換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.    換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.    重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將陽性對(duì)照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可。
三、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
若有 N 個(gè)待檢樣品，準(zhǔn)備 N+2 個(gè) qPCR 管(N 個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對(duì)照+6 個(gè)陽性對(duì) 照) ，向各 qPCR 管中分別加入下列成分。

成分	樣品管 N+2 個(gè)	qPCR 陰性對(duì)照	qPCR 陽性對(duì)照
2 × OneStep Probe Mix	各 10 μL	10 μL	10 μL
OneStep Probe Enzyme Mix	各 1 μL	1 μL	1 μL
郁金香碎色病毒 RT-qPCR 引物-探針混合液	各 4 μL	4 μL	4 μL

郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)。
四、添加模板(模板添加區(qū))
向 qPCR 管中分別加入 5 μl 模板，順序?yàn)殛幮詫?duì)照（DEPC-H2O）、待測(cè)樣品模板、郁金香碎色病毒 RT-qPCR 陽性對(duì)照，離心 30 秒，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
五、擴(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴(kuò)增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：

過程	溫度	時(shí)間
逆轉(zhuǎn)錄	50℃	20 min
預(yù)變性	95℃	3 min
qPCR 反應(yīng) （45 個(gè)循環(huán)）	95℃	15 sec
qPCR 反應(yīng) （45 個(gè)循環(huán)）	60℃	20 sec
信號(hào)通道	FAM 通道采集熒光信號(hào)

六、結(jié)果分析
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，推算出其濃度。
2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽性對(duì)照（1×10E5 拷貝/μL）結(jié)果：Ct 值<30 ，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，呈典型的 S 型曲線。
陰性對(duì)照結(jié)果：Ct 值>40 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。
樣本檢測(cè)結(jié)果：Ct 值<38 ，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，表明樣本中檢測(cè)出該病毒，結(jié)果為陽性；Ct 值>40 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測(cè)出該病毒，結(jié)果為陰性；Ct 值在38-40 范圍，應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Ct 值仍在 38-40 范圍，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，則判定為陽性，否則為陰性。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱
010702-50	病毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒（離心柱型）
020701-1	2 ×Probe qPCR Mix
020801-1	2×SYBR qPCR Mix

郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

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