引言
2023 年，Katalin Karikó 和 Drew Weissman 因在 mRNA 核苷堿基修飾方面重要的基礎(chǔ)性發(fā)現(xiàn)而榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，這一發(fā)現(xiàn)使得開發(fā)出針對(duì) COVID-19 的有效 mRNA 疫苗成為了可能[1]。在 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄 (In Vitro Transcription, IVT) 時(shí)摻入修飾的核苷, 如假尿苷 (Ψ)、N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 等, 可以降低其免疫原性、增強(qiáng)穩(wěn)定性并提高產(chǎn)出。IVT mRNA 的核苷修飾已有廣泛研究, 如核苷修飾的 COVID-19 mRNA 疫苗在較早之前已得到緊急使用授權(quán)[2]。近期，核苷修飾在 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄工藝流程中的安全性和有效性引發(fā)了行業(yè)內(nèi)外的高度關(guān)注。
理論基礎(chǔ)
2005 年，Katalin Karikó 等人首次發(fā)現(xiàn)將假尿苷 (Ψ) 引入 RNA 中能降低其免疫原性，并且 RNA 的免疫原性隨著假尿苷 (Ψ) 引入比例的增高而降低[3]。2008 年，Katalin Karikó 等人再次發(fā)現(xiàn)用假尿苷 (Ψ) 完全替代尿苷 (U) 的 mRNA 不僅能極大地降低 mRNA 的免疫原性，還能提高 mRNA 的穩(wěn)定性并增強(qiáng)其翻譯能力[4]。2010 年，Anderson 等人進(jìn)一步探究假尿苷 (Ψ) 增強(qiáng) mRNA 翻譯能力的原因，結(jié)果顯示，含有尿苷的 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄會(huì)激活 RNA 依賴性蛋白激酶 (PKR)，隨后磷酸化翻譯起始因子 (eIF-2α)并抑制翻譯，而含有假尿苷的 mRNA 在體外轉(zhuǎn)錄過程中較少的激活 PKR，其翻譯不會(huì)受到抑制[5]。
圖 1 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) 流程圖[6]
前沿動(dòng)態(tài)
2015 年，Oliwia Andries 等人證實(shí)用 N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 完全替代尿苷 (U) 比用假尿苷 (Ψ) 完全替代尿苷 (U) 更能降低 mRNA 的免疫原性，且更能增強(qiáng) mRNA 的蛋白表達(dá)能力[7]。2021 年，Pedro Morais 等人通過公開數(shù)據(jù)，對(duì)比了科威瓦克 (CureVac) 、輝瑞-拜恩泰科 (Pfizer-BioNTech) 和莫德納 (Moderna) 三家公司生產(chǎn)的 mRNA 疫苗有效性的差異，深入探討了 N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 對(duì) COVID-19 mRNA 疫苗的關(guān)鍵性貢獻(xiàn)[8]。2023 年，Thomas E. Mulroney 等人研究發(fā)現(xiàn) N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 摻入 mRNA 能夠誘導(dǎo)在核糖體滑動(dòng)序列處發(fā)生+1核糖體移碼，并通過設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)來證明 N1-甲基假尿苷誘導(dǎo)發(fā)生 +1 核糖體移碼的作用機(jī)理及減少移碼的可行方法[9]。
圖 2 從尿苷 (U) 到假尿苷 (Ψ) 異構(gòu)化及進(jìn)一步甲基化的示意圖[8]
目前，通過測(cè)定起始物料和反應(yīng)底物中核苷 (Nucleosides) 及核苷三磷酸 (NTPs) 的含量，可以用來判定反應(yīng)進(jìn)行的程度，全程監(jiān)控 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的過程，也可以用于優(yōu)化起始物料的配比，為后續(xù)工藝改進(jìn)提供思路。例如，使用低穩(wěn)態(tài)水平的 UTP，可以減少體外轉(zhuǎn)錄過程中 dsRNA 副產(chǎn)物的形成[10]；采用陰離子交換 HPLC 監(jiān)測(cè) mRNA 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，支持 mRNA 生產(chǎn)工藝開發(fā)[11]。
賽默飛應(yīng)用解決方案
01 Acclaim C30 應(yīng)用于尿苷、假尿苷和 N1-甲基假尿苷的分離
1.1 儀器配置及色譜條件
液相色譜儀：Vanquish™ Core HPLC 液相色譜系統(tǒng)，配置：泵 Quaternary Pump C，自動(dòng)進(jìn)樣器 Split Sampler CT，柱溫箱 Column Compartment C，檢測(cè)器 Diode Array Detector C，數(shù)據(jù)處理 Chromeleon™ 7.3
色譜柱：Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm (P/N: 078664)
流動(dòng)相、流速及洗脫程序：詳見應(yīng)用解決方案
進(jìn)樣量：5 μL；樣品盤溫度：15 ℃
柱溫：40 ℃
采集波長(zhǎng)：260 nm；采集頻率：10 Hz；
光譜采集：190-400 nm
1.2 分離譜圖及數(shù)據(jù)
02 Acclaim C30 應(yīng)用于 N1-甲基假尿苷及其含磷衍生物的分離
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2.1 儀器配置及色譜條件
液相色譜儀：Vanquish™ Core HPLC 液相色譜系統(tǒng)，配置：泵 Quaternary Pump C，自動(dòng)進(jìn)樣器 Split Sampler CT，柱溫箱 Column Compartment C，檢測(cè)器 Diode Array Detector C，數(shù)據(jù)處理 Chromeleon™ 7.3
色譜柱：Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm (P/N: 078664)
流動(dòng)相、流速及洗脫程序：詳見應(yīng)用解決方案
進(jìn)樣量：2 μL；樣品盤溫度：15 ℃
柱溫：15 ℃
采集波長(zhǎng)：260 nm；采集頻率：10 Hz；
光譜采集：190-400 nm
2.2分離譜圖及數(shù)據(jù)
03 關(guān)于 Acclaim C30 色譜柱[12]
3.1 Acclaim C30 可耐受 100% 水相，耐受 pH 范圍為 2-8，耐受溫度上限為 60 ℃
3.2 Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm 耐受壓力上限為 10000 psi，推薦流速 0.2–0.3 mL/min
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參考文獻(xiàn)
[1] The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2023. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023/summary/
[2] 侯書婷, 于傳飛, 王蘭, 王軍志. 體外轉(zhuǎn)錄mRNA藥物的技術(shù)進(jìn)展和應(yīng)用前景[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2023, 58(8): 2047-2058. DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0201
[3] Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H. and Weissman, D. Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity 23, 165–175 (2005).
[4] Karikó, K., Muramatsu, H., Welsh, F.A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S. and Weissman, D. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther 16, 1833–1840 (2008).
[5] Anderson, B.R., Muramatsu, H., Nallagatla, S.R., Bevilacqua, P.C., Sansing, L.H., Weissman, D. and Karikó, K. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 38, 5884–5892 (2010).
[6] Overview of In Vitro Transcription. https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/industrial/pharma-biopharma/nucleic-acid-therapeutic-development-solutions/mrna-research/overview-in-vitro-transcription.html
[7] Andries O, Mc Cafferty S, De Smedt SC, Weiss R, Sanders NN, Kitada T. N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. J Control Release. 2015 Nov 10;217:337-44. doi: 10.1016/j.jconrel.2015.08.051. Epub 2015 Sep 3. PMID: 26342664.
[8] Morais P, Adachi H, Yu YT. The Critical Contribution of Pseudouridine to mRNA COVID-19 Vaccines. Front Cell Dev Biol. 2021 Nov 4; 9:789427. doi: 10.3389/fcell.2021.789427. PMID: 34805188; PMCID: PMC8600071.
[9] Mulroney, T.E., Pöyry, T., Yam-Puc, J.C. et al. N1-methylpseudouridylation of mRNA causes +1 ribosomal frameshifting. Nature 625, 189–194 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06800-3
[10] Ziegenhals T, Frieling R, Wolf P, Göbel K, Koch S, Lohmann M, Baiersdörfer M, Fesser S, Sahin U, Kuhn AN. Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP. Front Mol Biosci. 2023 Dec 11;10:1291045. doi: 10.3389/fmolb.2023.1291045.
[11] Welbourne EN, Loveday KA, Nair A, Nourafkan E, Qu J, Cook K, Kis Z, Dickman MJ. Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development. Front Mol Biosci. 2024 Mar 7;11:1250833. doi: 10.3389/fmolb.2024.1250833. PMID: 38516194; PMCID: PMC10955092.
[12] Acclaim C30 column - Thermo ScientificTM AcclaimTM C30 columns provide unique selectivity and superior separations of hydrophobic, structurally related analytes.
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