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研究人員將一種名為CRISPR的細菌防御系統(tǒng)改造成為人類細胞（比方說腫瘤細胞）基因表達的強效活化劑，從而促進了基因功能的研究。

　　分子生物學家一直以來都有一個夢想，就是希望能夠隨意啟動任何基因的表達。機體內大多數(shù)基因的表達都是在特定生物學過程的控制之下進行動態(tài)啟動和關閉的，而對基因表達水平的操控技術則是研究基因、調控元件和信號通路的功能的一種關鍵方法。Konermann等人描述了一種簡潔的技術策略，可以將CRISPR/Cas9系統(tǒng)（即細菌內用于抵御外源性DNA的防御系統(tǒng)）轉變成為一種強效的選擇性基因活化劑。Konermann等人在文章中展示了如何用這一方法來檢測成千上萬個基因的并行啟動效果。

　　CRISPR是成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）的縮寫，是指細菌內用于編碼特殊RNA序列的DNA區(qū)域；這些特殊的RNA序列可以通過直接的序列互補作用來識別外源性DNA序列，例如病毒的DNA序列。在細菌中，這些向導RNA（guide RNA）能夠與Cas9酶結合形成復合物，或者與其他能特異性剪切被識別的DNA序列的蛋白質結合形成復合物，從而破壞被識別的DNA序列，保護細菌免受侵害。因此CRISPR/Cas9是一種可被操控的DNA靶向系統(tǒng)，其特異性取決于其RNA序列。

　　分子生物學家已經(jīng)利用此系統(tǒng)來促使基因組序列發(fā)生快速突變或替換——這一技術策略被稱為基因組編輯（genome editing）。2012年時，CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了突破性的進展，當時研究人員利用短鏈向導RNA（short guide RNA, sgRNA）分子來特異性地操控CRISPR，從而簡化了CRISPR/Cas9系統(tǒng)。研究人員在不久之后發(fā)現(xiàn)，Cas9的突變體dCas9雖然無法剪切DNA序列，但是卻能夠用來結合DNA。我們將dCas9連接到參與轉錄激活或轉錄抑制的蛋白質區(qū)域（或結構域）上，然后利用CRISPR，使其作用于調節(jié)特定基因轉錄的啟動子序列，如此一來，這些融合蛋白就能夠調節(jié)基因的自然表達水平。然而，對于眾多應用領域而言，這種方式對基因表達水平的影響效果太低——基因活化程度小于或約等于五倍。

　　Konermann等人將CRISPR sgRNA轉變成為一種可將多個不同的轉錄激活因子組裝起來的模塊化平臺，從而解決了該方法基因活化效率低的問題（圖1a）。RNA結合蛋白可以結合到RNA的一些短序列上，而Konermann等人則在sgRNA上確定了兩個有此類短序列的區(qū)域，而這兩個區(qū)域反過來能夠融合到哺乳動物體內不同轉錄因子的轉錄激活區(qū)域上。Konermann等人將該系統(tǒng)命名為協(xié)同激活介導因子（synergistic activation mediator, SAM）。機體內有12個基因無法被dCas9-激活因子融合蛋白有效地激活，而Konermann等人證明，SAM系統(tǒng)能夠誘導激活這12個基因，基因活化倍數(shù)可達到100倍以上。

圖1 RNA可作為基因調控的模塊化支架。a. Konermann等人對天然的CRISPR短鏈向導RNA（short guide RNA, sgRNA）分子進行了改良，使其變成蛋白質裝配的模塊化支架；改良后的CRISPR sgRNA可形成復合物，利用多個轉錄調控區(qū)域的作用，來特異性地調節(jié)基因表達水平。sgRNA上的適配體（aptamer）結構可以招募特殊的蛋白質：在本案例中，適配體招募的蛋白質是與不同轉錄因子的轉錄激活域相融合的RNA結合蛋白。由于CRISPR RNA的不同區(qū)域均可以與靶DNA序列進行堿基互補配對，因此sgRNA復合物具有良好的DNA靶向特異性。dCas9酶通常都與CRISPR RNA結合在一起，有助于打開DNA的結構；dCas9也能夠融合到另一個調控區(qū)域中，進而增加生物學效應的多樣性。b. CRISPR系統(tǒng)的改良工作體現(xiàn)了天然的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的設計原則，lncRNA能夠招募多種可修飾染色質（即細胞核內組蛋白與DNA形成的復合體）、調節(jié)基因表達的細胞因子。

　　為了說明該方法的潛在應用價值，Konermann等人創(chuàng)建了一個sgRNA數(shù)據(jù)庫，匯總了一系列能夠分別啟動23000個人類基因的改良后的sgRNA。他們隨后逐個探討哪個基因在被sgRNA激活后，可以促使黑色素瘤癌細胞逃避PLX-4720（治療黑色素瘤的主要藥物）的殺傷作用。不同的基因被激活后，可以使黑色素瘤癌細胞產(chǎn)生不同程度的抗藥性，而抗藥性的高低則取決于細胞在接受藥物治療后sgRNA的相對頻率。在高度富集的sgRNA中，有一些sgRNA可以啟動已知耐藥性通路中的基因，還有一些sgRNA可以啟動在抗藥性黑色素瘤患者體內表達水平增高的基因，這就可以證明，SAM法能夠確定基因表達水平改變后會發(fā)生哪些生物相關性結局。

　　CRISPR改良工作的成功可用于直接揭示天然的基因調控機制。增強子（enhancer）是一種能夠啟動基因表達的DNA序列，它們通常都含有一些可識別不同轉錄因子的識別序列。此外，增強子和其它調控元件通常都會轉錄出長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA），這種RNA可以作為模塊支架，利用各種各樣可修飾染色質（即細胞核內由組蛋白與DNA形成的復合物）的細胞因子，調控基因的表達（圖1b）。lncRNA就像放大的分子“菜譜"，既能夠指導一系列生化作用的組合，也能夠指導這些生化作用應該去影響哪些基因組位置。

　　zui近還有另外兩項研究也證明，在將dCas9或CRISPR RNA改良成模塊化支架后，就大大提高了CRISPR引導性基因調控技術的效率或靈活性。其中一項研究還進一步表明，多種改良后的CRISPR RNA能夠同時啟動和關閉同一細胞內的不同基因，從而操控某一條代謝通路。Konermann等人的研究發(fā)現(xiàn)以及這兩項研究均表明，天然lncRNA的模擬技術是一種有效的、協(xié)調多個蛋白質的方式，可以使這些蛋白質共同對整個基因組內產(chǎn)生影響。我們用一個sgRNA分子，也許就能夠讓各種效應蛋白作用于相同的基因組位置上。由于這類研究工具在生物技術領域中具有廣泛的實用性，因此我們也有必要進一步構建一些新的多功能人工蛋白或非編碼RNA。

　　下一代CRISPR技術為我們提供了一個的機會來研究多個基因和DNA序列的功能。在過去十年里，RNA干擾技術已經(jīng)被廣泛用于研究基因功能缺失后所造成的影響，但是由于存在非特異性靶向作用，因此這種方法出現(xiàn)假陽性結果的概率非常高。與此同時，如果利用過表達技術來開展功能獲得性研究的話，可能無法闡明正常的RNA調控過程，例如選擇性剪接（alternative splicing）。我們雖然可以根據(jù)鋅指蛋白和TALEN等DNA結合蛋白的結構來合成人工轉錄因子，作為改變基因表達水平的備選方法，但是我們卻難以在全基因組范圍內構建這些人工轉錄因子。因此，CRISPR技術擁有其他技術*的強大優(yōu)勢：即CRISPR數(shù)據(jù)庫的全面覆蓋性以及CRISPR方法的模塊化特性。然而，CRISPR靶向技術也會產(chǎn)生脫靶效應（off-target effect），因此，如果我們利用這種方法來確定基因表達水平的改變會造成哪些影響，那么還需要開展額外的驗證性試驗來進行證實。

　　Konermann等人對黑色素瘤細胞進行了實驗，zui終確定了13個特殊的基因：當每個基因的表達水平發(fā)生改變時，都可以使黑色素瘤細胞產(chǎn)生抗藥性。然而，一般而言，只有當多個基因同時進行復雜調控時，才能夠導致疾病或嚴重生物學效應的發(fā)生——有一個很好的例子可以說明這一點：研究人員發(fā)現(xiàn)，四個基因必須同時進行表達時，才能夠促使誘導性多潛能干細胞（induced pluripotent stem cell，是成熟細胞所產(chǎn)生的一類干細胞）的生成。因此，我們需要詳盡地了解基因調控網(wǎng)絡，也需要利用基因分庫和基因劑量來進行實驗，以便確定是哪些基因共同決定了某些性狀。CRISPR/Cas系統(tǒng)將會成為一個用于實現(xiàn)該目標的工具，這是因為該系統(tǒng)能夠對各種不同的效應結構域進行多重靶向和多重調控。