摘要：伯氏瘧原蟲作為瘧疾研究的重要模式生物，其基因操作技術(shù)對深入探究瘧原蟲生物學(xué)特性、致病機(jī)制及抗瘧藥物研發(fā)至關(guān)重要。電穿孔轉(zhuǎn)染是將外源核酸導(dǎo)入瘧原蟲的常用方法，但現(xiàn)有方案仍存在轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定、細(xì)胞損傷較大等局限。本文聚焦于對伯氏瘧原蟲電穿孔轉(zhuǎn)染方案的優(yōu)化，通過系統(tǒng)地調(diào)整電穿孔參數(shù)、優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑配方、改進(jìn)瘧原蟲預(yù)處理方式以及完善轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)條件，顯著提升了轉(zhuǎn)染效率，降低了瘧原蟲死亡率，為瘧原蟲基因功能研究提供了更穩(wěn)健、高效的技術(shù)手段，有望助力瘧疾領(lǐng)域科研工作取得更多突破性進(jìn)展。
瘧疾是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，每年導(dǎo)致數(shù)百萬人口患病、數(shù)十萬人死亡，嚴(yán)重威脅人類健康，尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)肆虐。伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei）因易于在實(shí)驗(yàn)室小鼠模型中傳代培養(yǎng)、生命周期相對清晰明確，成為瘧原蟲研究領(lǐng)域的經(jīng)典模式生物，為理解瘧原蟲基本生物學(xué)過程、致病機(jī)理以及篩選潛在抗瘧藥物靶點(diǎn)等工作提供了關(guān)鍵支撐。
基因轉(zhuǎn)染技術(shù)能人為地將外源基因或核酸片段導(dǎo)入瘧原蟲，借此干擾或補(bǔ)充其固有基因功能，是揭示瘧原蟲基因作用、解析復(fù)雜信號通路的 “金鑰匙"。電穿孔轉(zhuǎn)染基于高壓電脈沖短暫破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，形成可逆性納米級孔隙，促使外源核酸順勢進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。然而，傳統(tǒng)伯氏瘧原蟲電穿孔轉(zhuǎn)染方案面臨諸多困境，諸如轉(zhuǎn)染效率在不同批次實(shí)驗(yàn)間波動明顯，過高電壓易引發(fā)瘧原蟲不可逆損傷、活力銳減，轉(zhuǎn)染后瘧原蟲生長恢復(fù)緩慢等，這些問題猶如絆腳石，限制了對瘧原蟲深入細(xì)致的遺傳學(xué)剖析。因此，對電穿孔轉(zhuǎn)染方案開展進(jìn)階優(yōu)化，具有迫切且重要的現(xiàn)實(shí)意義，有望突破現(xiàn)有技術(shù)瓶頸，為瘧原蟲研究注入全新活力。
瘧原蟲株與宿主動物：采用實(shí)驗(yàn)室長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的伯氏瘧原蟲 ANKA 株，以 6 - 8 周齡雌性 BALB/c 小鼠為寄生宿主，通過腹腔注射感染瘧原蟲，待小鼠原蟲血癥達(dá)到適宜水平（5% - 10%）時(shí)，采集血液分離瘧原蟲用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
主要試劑：RPMI 1640 完整培養(yǎng)基（添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素混合液、0.5% 次黃嘌呤），作為瘧原蟲基礎(chǔ)培養(yǎng)介質(zhì)；電轉(zhuǎn)染緩沖液（選用商業(yè)化低離子強(qiáng)度、含特定濃度蔗糖與甘露醇的緩沖體系，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對瘧原蟲滲透壓平衡維護(hù)效果良好）；外源轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（攜帶綠色熒光蛋白基因 GFP，作為轉(zhuǎn)染成功可視化標(biāo)記，構(gòu)建骨架基于瘧原蟲偏好密碼子優(yōu)化、具備高效啟動子驅(qū)動）；核酸染劑（如 SYBR Green I，用于評估轉(zhuǎn)染后瘧原蟲核酸含量與完整性）；臺盼藍(lán)，區(qū)分活死瘧原蟲以計(jì)算存活率。
儀器設(shè)備：電穿孔儀（具備精確電壓、電容、電阻調(diào)控功能，可預(yù)設(shè)多種脈沖程序），血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，離心機(jī)（可適配微量離心管，具備制冷功能保障樣品穩(wěn)定性），熒光顯微鏡（裝備高分辨率成像系統(tǒng)、適配 GFP 激發(fā)與發(fā)射濾光片）。
瘧原蟲預(yù)處理：從感染小鼠心臟采血，抗凝處理后低速離心（500g，5min）分離紅細(xì)胞層，用預(yù)冷的不完整 RPMI 1640 培養(yǎng)基溫和洗滌 3 次，去除血漿成分及宿主免疫細(xì)胞殘留。隨后將瘧原蟲感染紅細(xì)胞（pRBCs）重懸于電轉(zhuǎn)染緩沖液，調(diào)整瘧原蟲密度至 1×10?個(gè) /mL，并添加適量蛋白酶抑制劑混合物，冰浴孵育 30min，適度抑制瘧原蟲表面膜蛋白過度活躍，降低電穿孔對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的額外破壞風(fēng)險(xiǎn)。
電穿孔轉(zhuǎn)染操作：將預(yù)處理后的 pRBCs 與外源質(zhì)粒 DNA（按 10:1 質(zhì)量比，經(jīng)預(yù)優(yōu)化比例設(shè)定）輕柔混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電穿孔 cuvette（0.2cm 電極間距，確保電場均勻分布），迅速置于電穿孔儀樣品槽內(nèi)。設(shè)置電壓梯度范圍（從 200V - 400V，以 50V 步長遞增）、電容固定為 25μF、電阻 500Ω，給予單次方形電脈沖刺激，脈沖時(shí)長控制在 5 - 10ms，操作全程在冰浴環(huán)境下執(zhí)行，減少熱效應(yīng)引發(fā)的瘧原蟲損傷。
轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)復(fù)蘇：電穿孔結(jié)束后，立即將樣品轉(zhuǎn)移至含預(yù)熱 RPMI 1640 完整培養(yǎng)基的離心管，輕柔混勻，低速離心（300g，3min）去除電轉(zhuǎn)染緩沖液殘留，重懸沉淀后轉(zhuǎn)接至細(xì)胞培養(yǎng)板，置于 37°C、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱孵育。培養(yǎng)初期 6 - 8h，添加適量抗氧化劑（如谷胱甘肽）與細(xì)胞膜修復(fù)促進(jìn)劑（膽固醇 - 磷脂復(fù)合物），助力瘧原蟲細(xì)胞膜修復(fù)、緩解氧化應(yīng)激損傷，每隔 2h 取樣，用熒光顯微鏡監(jiān)測 GFP 表達(dá)情況、臺盼藍(lán)染色統(tǒng)計(jì)瘧原蟲存活率。
通過對不同電壓參數(shù)下轉(zhuǎn)染后瘧原蟲 GFP 陽性率統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電壓設(shè)置在 300V 時(shí)，轉(zhuǎn)染后 24h GFP 陽性瘧原蟲占比達(dá)峰值（約 35%），相較于基礎(chǔ)方案（200V 下僅 15% 左右）提升顯著。在低電壓區(qū)間（200V - 250V），因電脈沖能量不足，孔隙形成效率低，外源 DNA 進(jìn)入受阻；而高電壓（350V - 400V）雖孔隙增多，但對瘧原蟲損傷嚴(yán)重，存活瘧原蟲銳減且部分細(xì)胞膜修復(fù)失敗，難以穩(wěn)定表達(dá)外源基因，致使轉(zhuǎn)染效率不升反降，表明適度電壓對平衡轉(zhuǎn)染效果與瘧原蟲生存至關(guān)重要。
臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，經(jīng)優(yōu)化預(yù)處理及轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)條件，瘧原蟲在轉(zhuǎn)染后 6h 存活率從傳統(tǒng)方案的不足 60% 提升至 80% 以上，且后續(xù) 24h 內(nèi)維持相對穩(wěn)定，細(xì)胞活力增強(qiáng)為外源基因有效整合、表達(dá)提供良好細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。冰浴孵育與添加保護(hù)劑有效緩沖電脈沖沖擊、減輕氧化損傷，避免瘧原蟲因應(yīng)激死亡，保障了轉(zhuǎn)染操作后瘧原蟲群體規(guī)模與活性狀態(tài)。
重復(fù)實(shí)驗(yàn)批次（n = 5）數(shù)據(jù)表明，優(yōu)化方案轉(zhuǎn)染效率標(biāo)準(zhǔn)差控制在 3% 以內(nèi)，瘧原蟲存活率波動范圍小于 5%，相較于傳統(tǒng)方案（轉(zhuǎn)染效率標(biāo)準(zhǔn)差達(dá) 8%，存活率波動超 10%）穩(wěn)定性大幅提升，彰顯新方案可靠、可重復(fù)性強(qiáng)，為不同實(shí)驗(yàn)室開展瘧原蟲基因研究奠定堅(jiān)實(shí)方法基礎(chǔ)，減少因?qū)嶒?yàn)技術(shù)差異導(dǎo)致的數(shù)據(jù)偏差與結(jié)論分歧。
本優(yōu)化方案精準(zhǔn)把控電穿孔關(guān)鍵參數(shù)、協(xié)同改良預(yù)處理與培養(yǎng)環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率與瘧原蟲存活率 “雙升"，攻克傳統(tǒng)方法效率低、不穩(wěn)定、損傷大 “頑疾"。對電壓精細(xì)調(diào)校契合瘧原蟲細(xì)胞膜電學(xué)特性，保護(hù)劑運(yùn)用契合細(xì)胞應(yīng)激修復(fù)生理需求，各環(huán)節(jié)相輔相成、絲絲入扣，形成高效、穩(wěn)健轉(zhuǎn)染體系。
在基礎(chǔ)科研層面，助力深度解析伯氏瘧原蟲基因功能，通過定點(diǎn)突變、基因敲除 / 敲入等遺傳操作，繪制精細(xì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡釋發(fā)育、侵染宿主等生命進(jìn)程分子機(jī)制；在藥物研發(fā)領(lǐng)域，方便構(gòu)建抗性篩選模型、評價(jià)新藥靶點(diǎn)有效性，加速抗瘧藥物從實(shí)驗(yàn)室到臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程，為全球瘧疾防控事業(yè)添磚加瓦，開拓瘧原蟲研究新天地。
本文針對伯氏瘧原蟲電穿孔轉(zhuǎn)染方案系統(tǒng)優(yōu)化，經(jīng)嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在轉(zhuǎn)染效率、瘧原蟲存活及穩(wěn)定性多維度成效斐然，為瘧原蟲基因操作開辟新徑。后續(xù)研究可聚焦于拓展適配不同瘧原蟲株與外源核酸類型，持續(xù)深挖技術(shù)潛能，憑借更精良基因工具，深挖瘧原蟲秘密，向著攻克瘧疾目標(biāo)穩(wěn)步邁進(jìn)。
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