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【科捷儀器】

  由于高效液相色譜系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)界的用戶越來越多，了解高效液相色譜技術(shù)和儀器裝置及工作原理很有必要。南京科捷在本文中簡述高效液相色譜技術(shù)的系統(tǒng)組成、工作原理、臨床應(yīng)用及常見故障處理。

1   高效液相色譜法（High Perfor mance Liquid Chrom atograph Y HPLC）

    隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，要求分離出入體中某種特定化合物，并給予定性分析和定量測(cè)定。色譜技術(shù)是一種常用的分離技術(shù)，它的分離原理是基于混合物中各組分在經(jīng)過一個(gè)由固定相和流動(dòng)相組成的體系時(shí)，由于各組分在化學(xué)性質(zhì)上的差異，在兩相中具有不同的分配系數(shù)，兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，被分析的混合組分隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng)，并在兩相中進(jìn)行多次的吸附和分配，使得那些分配系數(shù)只有很小差別的組分。在移動(dòng)速度上產(chǎn)生很大差別，從而使各組分得到分離。通俗地說流動(dòng)相就是帶動(dòng)樣品在色譜柱里流動(dòng)的物質(zhì)，它相當(dāng)于溶劑，固定相就是填充在柱子里的物質(zhì)，它相當(dāng)于吸附劑。每種固定相都具有不同的性質(zhì)。

    流動(dòng)相是氣體的叫氣相色譜。流動(dòng)相是液體的就叫液相色譜。氣相色譜法具有快速，分離效率高。用樣量少等特點(diǎn)，但要求樣品能夠汽化。從而受到樣品的揮發(fā)性限制。

    高效液相色譜法（HPLC）是由現(xiàn)代高壓技術(shù)與傳統(tǒng)的液相色譜方法相結(jié)合，加上高效柱填充物和高靈敏檢測(cè)器所發(fā)展起來的新型分離分析技術(shù)。由于它只要求樣品能制成溶液，而不需要汽化，因此不受樣品揮發(fā)性的約束。對(duì)于揮發(fā)性低，熱穩(wěn)定性差，分子量大的高分子化合物以及離子型化合物尤為有利。如氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿、核酸、甾體、脂類、維生素、抗生素等分子量較大。沸點(diǎn)較高的合成藥物以及無機(jī)鹽類。所以說HPLC具有適用范圍廣、分離效率高、速度快、流動(dòng)相可選擇范圍寬、靈敏度高、色譜柱可反復(fù)使用、流出組分容易收集等優(yōu)點(diǎn)。

    不同種類的柱可以進(jìn)行不同類型的液相色譜分離，也產(chǎn)生了不同的液相色譜法。如正向色譜、反向色譜、離子對(duì)色譜、離子交換色譜、凝膠色譜等。

2  高效液相色譜系統(tǒng)及工作原理

    高效液相色譜系統(tǒng)流程如圖1所示

圖1高效液相色譜系統(tǒng)流程圖

    由流程圖可看出系統(tǒng)是由儲(chǔ)液器，泵，進(jìn)樣器，分離柱，檢測(cè)器，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入進(jìn)樣系統(tǒng)或進(jìn)樣器。樣品通過進(jìn)樣器以精確的體積插入流動(dòng)相中。再被流動(dòng)相帶到柱內(nèi)，分離過程在柱內(nèi)進(jìn)行，被分離成單個(gè)組分的樣品依次從柱內(nèi)流出，通過檢測(cè)器樣品濃度被轉(zhuǎn)變成電信號(hào)送到記錄器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)，經(jīng)系統(tǒng)處理。數(shù)據(jù)以圖譜和圖表形式打印出來。

3  高效液相色譜儀在醫(yī)院臨床中的應(yīng)用

    HPLC技術(shù)主要應(yīng)用是在臨床藥學(xué)和臨床學(xué)中。臨床藥學(xué)主要是治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）和藥代動(dòng)力學(xué)。HPLC之所以在TDM中占有重要地位。其主要原因是：

    （1）可以同時(shí)監(jiān)測(cè)不同種類的藥物。

    （2）一次進(jìn)樣可同時(shí)分析原藥及代謝產(chǎn)物。

    （3）分離和定量同時(shí)進(jìn)行．具有較高的準(zhǔn)確性和精確度。此外HPLC還具有*的經(jīng)濟(jì)效益比，花費(fèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它傳統(tǒng)方法。目前用HPLC分析臨床常用藥物超過數(shù)百種。已廣泛用于TDM中的如抗癲癇藥，抗心律失常藥。茶堿．撲熱息痛，環(huán)孢霉索等。在臨床研究方面，許多復(fù)雜化合物或內(nèi)源代謝物也可用HPLC法分析。如血中兒茶酚胺、氨基酸、激素、前列腺素、多肽、核酸等。
此外HPLC還可應(yīng)用到臨床診斷中，如在新生兒疾病篩查中，開發(fā)了血紅蛋白病的Hb，苯丙酮尿酸癥的PKU，成神經(jīng)細(xì)胞瘤等方法。

    需要注意的是臨床樣品都是生物樣品，如血、尿、痰、體液等，成分復(fù)雜，性質(zhì)各異，生物大分子多，必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，去除某些干擾物。處理時(shí)嚴(yán)格按要求去做，否則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或造成柱的阻塞，甚至報(bào)廢。

4  高效液相色譜儀常見故障處理

    故障l  系統(tǒng)壓力不穩(wěn)，噪音增加，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。

    原因  管道中吸入空氣，溶人流動(dòng)相中的空氣．泵墊圈磨損引起的泄漏，微粒污染單向閥均可引起上述癥狀。

    處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量，保證不銹鋼濾器（沉子）沉人儲(chǔ)液器瓶底，避免吸入空氣。流動(dòng)相要充分脫氣。泵墊圈是系統(tǒng)中zui易磨損的部件，泵墊圈的磨損易造成高壓下的壓力不穩(wěn)，并會(huì)由泵頭滲出流動(dòng)相，一旦發(fā)現(xiàn)立即換上新墊圈，有條件的應(yīng)定期更換泵墊圈。上述問題解決后泵仍不能正常工作，考慮單向閥的微粒污染問題。小心地拆下單向閥，放入10％的硝酸溶液中超聲清洗15分鐘．再反復(fù)用色譜級(jí)水清洗數(shù)遍，zui后用甲醇清洗兩次，用洗耳球由進(jìn)液方向反吸氣，如不通氣說明故障已排除，裝上單向閥即可。

    故障2  柱壓高。

    原因  一是樣品沉積在柱內(nèi)，二是柱內(nèi)濾片阻塞。

    處理  對(duì)*種情況，可用能溶解所測(cè)樣品的溶劑沖洗，沖洗時(shí)拆開柱與檢測(cè)器之間的接頭，正向沖洗，或?qū)⒅隹诮釉诒蒙戏聪驔_洗。注意不要讓沖洗液通過檢測(cè)器流動(dòng)池，避免流動(dòng)池污染。沖洗30分鐘后接上檢測(cè)器。若沖洗不見效，考慮第二種情況，更換柱頭濾片。

    故障3  出峰不佳，峰分叉（雙峰）。

    原因  柱頭填料塌陷。

    處理  擰開柱頭，取出濾片，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分（污染的填料），裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷．再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平面光滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇。再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。擦干凈柱外壁的填料，加上新濾片，擰緊柱頭，接上泵沖洗，用流動(dòng)相沖洗30分鐘后再接檢測(cè)器。

    故障4  換柱后出現(xiàn)峰肩。

    原因  柱安裝位置不佳。

    處理  松開柱，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)一角度，重新安裝上緊，*甲醇沖洗30分鐘即可。

    故障5  峰面積改變。

    原因  加樣針不到位。

    處理檢查加樣針是否插到底．保證針到位。實(shí)際工作中碰到的問題很多，日常保養(yǎng)很重要。如儲(chǔ)液器的清潔，流動(dòng)相的脫氣，每天用后系統(tǒng)中的緩沖液要沖洗干凈。先用蒸餾水沖洗15分鐘，然后用甲醇沖洗，防止無機(jī)鹽沉積造成系統(tǒng)內(nèi)的磨損和阻塞，這些都可以減少故障的發(fā)生。另外對(duì)HPLC技術(shù)及設(shè)備原理的了解也非常重要，這樣就能夠提高儀器的利用率，更好地發(fā)揮儀器作用。