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熒光分光光度計是屬于分光光度計的一種，在生物化學、生物醫(yī)學、環(huán)境化工等部門的應用較為廣泛，熒光分光光度計是對經(jīng)光源激發(fā)后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)或經(jīng)化學處理后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)成份分析的儀器物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài), 這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，在返回基態(tài)的過程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產(chǎn)生熒光．不同物質(zhì)由于分子結構的不同,其激發(fā)態(tài)能級的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其特征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。熒光分光光度計的工作原理就是根據(jù)這一現(xiàn)象設計的，是由高壓汞燈或氙燈發(fā)出的紫外光和藍紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中，激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)過濾過和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來。
二、熒光分光光度計構成
隨著科技的進步帶動著生產(chǎn)工藝技術的提升熒光分光光度計的從手控式熒光分光光度計發(fā)展到自動記錄式熒光分光光度計以及現(xiàn)在的計算機控制式熒光分光光度計都是有以下幾部分組成。
1、光源
一般是為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發(fā)射出強度較大的連續(xù)光譜，且在300nm～400nm 范圍內(nèi)強度幾乎相等，所以更為常用。
2、激發(fā)單色器
作為篩選特定的激發(fā)光譜器是置于光源和樣品室之間，也稱喂單色器。
3、發(fā)射單色器
作為篩選特定的發(fā)射光譜器也成為第二單色器，是至于置于樣品室和檢測器之間。常采用光柵為單色器
4、樣品室
用于盛放樣品的空間，通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。樣品不同時光源與檢測器的角度有所不同，測量固體樣品是直角，測量液體樣品時銳角。
5、檢測器
作為光信號放大的同時還是將光信號轉(zhuǎn)化為電信號。一般是用光電管或光電倍增管作檢測器。
三、熒光分光光度計使用方法
（一）實驗前準備工作
1、實驗所需樣品若是液體時，要檢查濃度范圍是否合適，是否需要稀釋，以及所需要的溶劑類型以及稀釋倍數(shù)。
2、實驗所需樣品若是固體時，要產(chǎn)看是否為均勻粉末、片狀、是否可直接測定等。
3、檢查電源電壓是否符合設備要求，以及接地設施是否連接。
4、查看環(huán)境是否符合設備工作所需環(huán)境要求，環(huán)境溫度應在20℃±5℃;相對濕度不大于70%;電源穩(wěn)定，無磁場、電場干擾。
5、測試前設備要進行預熱
（二）操作步驟
1、在之前的準備工作完成后，接通電源，然后打開主機開關[much]后打開光源開關。
注意：要根據(jù)使用說明來啟動計算機。并且要進行預熱。
2、預熱完成夠，按照說明查看是否需要對設備進行校準。
注意：儀器一般是在20天內(nèi)必須從新進行一次激發(fā)校準和發(fā)射校準
3、.基本測定
①熒光激發(fā)光譜測定
設置儀器參數(shù)，掃描發(fā)射波長，找到max λ ex、max λ em，以此為發(fā)射波長，記錄發(fā)射強度作為激發(fā)波長的函數(shù)，便得到激發(fā)光譜。
②熒光發(fā)射光譜測定
設置儀器參數(shù)，掃描激發(fā)波長，找到max λ ex、max λ em，以此為激發(fā)波長，記錄發(fā)射強度與發(fā)射波長間的函數(shù)關系，便得到熒光發(fā)射光譜。
③差譜測定
設置儀器參數(shù)，選擇合適的工作方式，測定背景溶液的發(fā)射光譜并儲存起來，在一定的工作方式下，掃描樣品溶液的發(fā)射波長，得到當時的光度值和儲存的背景值之間的差示值，即差譜。
④峰面積積分
選擇適當?shù)墓ぷ鞣绞?，對樣品溶液進行積分操作，即得到峰面積積分。
⑤熒光強度
選擇合適的測量參數(shù)，設置λ ex、λ em，采用定點讀數(shù)或掃描方式，即可測得所選波長處的熒光強度。
⑥定量測定
配制一系列已知濃度的標準溶液，在一定的測定條件下，設置λ ex、λ em，按照由稀至濃的次序，測定標準溶液的熒光強度，繪制熒光強度濃度的工作曲線，不改變儀器參數(shù)測定未知溶液的熒光強度，由工作曲線即可求出未知溶液的濃度。
4、分析結果
①熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及其他光譜由儀器控制電腦直接繪出。
②峰面積積分、熒光強度由儀器控制電腦計算顯示。
③定量測試：在相同的測定條件下，測定一系列已知濃度的標準溶液的熒光強度，繪制出熒光強度-濃度的工作曲線。濃度未知的溶液的熒光強度測定后，由工作曲線求出該溶液的濃度。
四、熒光粉光光度計使用注意事項
（一）日常注意事項
1、開機時，請先開氙燈電源，再開主機電源。注意開機順序。
2、每次開機后請先確認兩邊排熱風扇是否工作正常如發(fā)現(xiàn)風扇有故障，應停機檢查。
3、主機工作時頂部排熱器溫度很高，切勿觸摸以免受傷。
4、請盡量減少不必要的氙燈觸發(fā)次數(shù)，避免氙燈在高壓下反復觸發(fā)。關閉氙燈電源后，若要重新使用，請等待60秒以后重新觸發(fā)。
5、運行未知濃度的樣品測試時，靈敏度設置請從低位向高圍( 0-7)逐步設置。
6、當操作者錯誤操作或其他干擾引起微機錯誤時，應該立即關斷主機電源重新啟動，但無須關斷氙燈電源。
7、單色器內(nèi)用螺絲緊固處不得松動。
（二）其他注意事項
1、所需溶液要是已經(jīng)配置好要查看在低溫冰箱里的存放的時間是否超過一星期，如果已超過則需從新配置。
2、實驗所用的樣品池是四面透光的石英池，拿取的時候用手指掐住池體的上角部，不能接觸到四個面，清洗樣品池后應用擦鏡紙對其四個面進行輕輕擦拭。
3、在測試樣品時，注意熒光強度范圍的設定不要太高，以免測得的熒光強度超過儀器的測定上限。
4、實驗結束后及時的清理臺面，處理廢液，清洗和放置好樣品池，將下次要用的溶液放回冰箱。
5、清潔儀器外表時請勿使用乙醇等有機溶劑，請勿在工作中清潔。不使用時請加防塵罩要保持比色皿的清潔。
五、熒光分光光度計選購指南
1、首先要考慮品牌以及代理商信譽以及售后服務，不僅關系到儀器的質(zhì)量穩(wěn)定性，還關系到以后的維修服務。
2、然后要關注儀器的狹縫(光譜帶寬)，狹縫還決定了儀器的分辨率，良好的分辨率可以分辨間隔很小的波峰。
3、儀器的信噪比是一項非常重要的參數(shù)，它一定程度上反映儀器的檢出能力。
4、波長[accuracy]度和重復性也是一項比較重要的指標。
5、掃描速度雖然也很重要，但這和需求有關系，如果對時間沒有太多的要求，可以不必在意。
6、綜合以上進行對比選購性價比較為高的。
六、熒光分光光度計與其他分光光度計不同點
相同點：比色皿、檢測器、記錄儀這些基本一樣
不同點：光源，是否需要色劑
紫外、可見分光光度計在紫外區(qū)使用氫燈或氘燈，在可見光區(qū)使用氘燈或溴鎢燈。它們發(fā)出的都是連續(xù)光譜，通過三棱鏡（中檔）、光柵（高檔）、濾光片（低級）等分光，這樣兩種燈組合基本涵蓋了紫外-可見光的波長范圍。
熒光分光光度計由氙弧燈發(fā)出的光通過切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上。
紫外-可見分光光度計可用于大部分有色物質(zhì)的定量監(jiān)測，通常需要使用各種各樣的顯色劑。熒光分光光度計可用于測試發(fā)光材料的發(fā)射光譜＼激發(fā)光譜＼時間掃描，不需要顯色劑。