細胞名稱：NCI-H1975細胞 [H-1975, H1975]

描述：

Description 人非小細胞肺癌細胞NCI-H1975 [H-1975, H1975]建系于1988年7月，來源于一位不吸煙的女士。每個批次均通過本庫支原體檢測，結(jié)果為陰性。經(jīng)本庫STR檢測無誤。STR鑒定結(jié)果為：Amelogenin: X; CSF1PO: 12; D13S317: 10,13; D16S539: 9,12; D5S818: 11,12; D7S820: 8,11; THO1: 7; TPOX: 8,11; vWA: 18

動物種別：人

性別：女

組織來源：Tissue and Cell Type 肺

形態(tài)：Morphology 上皮樣，貼壁生長

培養(yǎng)基和添加劑：Complete Growth Medium and Culture Conditions 人肺癌細胞NCI-H1975 [H-1975, H1975]*培養(yǎng)液配方（100 ml）：

REFERENCE NCI-Navy Medical Oncology Branch Cell Line Supplement. J. Cell. Biochem. suppl. 24: 1996. Sordella R, et al. Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways. Science 305: 1163-1167, 2004. PubMed: 15284455

傳代培養(yǎng)及其操作步驟

原代細胞培養(yǎng)成功以后，需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株)，可以進行細胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代細胞形成細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。

1、操作步驟：

（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。

（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。

（4）吸出消化液，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。

（6）用計數(shù)板計數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

（7）細胞培養(yǎng)換液時間應根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。

2、注意事項：

（1）掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導致細胞脫落、損傷。

（2）掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時，消化時間應縮短，過低時細胞消化時間相對延長。

NCI-H1975細胞

人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞 95-D

人肺癌細胞 A549

人肺癌細胞+RFP A549+RFP

人肺癌細胞熒光素酶標記 A549+luc

人肺癌細胞 Calu-1

人肺癌細胞 DMS 53

人非小細胞肺癌細胞 HCC827

人非小細胞肺癌細胞熒光素酶標記 HCC827+LUC

人非小細胞肺癌細胞 NCI-H1299

人肺癌細胞 NCI-H1437

人經(jīng)典小細胞肺癌細胞 NCI-h1688

人肺癌細胞 NCI-H1703

人肺癌細胞 NCI-H1944

人肺癌細胞 NCI-H2126

人肺癌細胞 NCI-H2228

人肺癌細胞 NCI-H23

人肺癌細胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移) NCI-H292

人非小細胞肺癌細胞 NCI-H358

人小細胞肺癌細胞 NCI-H446

人大細胞肺癌細胞 NCI-H460 [H460]

人非小細胞肺癌細胞 NCI-H524

人大細胞肺癌細胞 NCI-H661[h661]

人小細胞肺癌細胞 NCI-H82

人肺癌細胞 pc-9

人小細胞肺癌 SBC-2

人小細胞肺癌細胞 SHP-77

小鼠肺癌細胞 LLC

小鼠肺癌細胞熒光素酶標記 LLC+LUC

原代培養(yǎng)及其操作步驟

原代分離細胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后，經(jīng)機械以及消化分離成單個細胞或單一型細胞群，使之在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定的營養(yǎng)條件下，生存、生長和繁殖。原代培養(yǎng)細胞常有不同的細胞成分，生長緩慢，但是更能代表所來源的組織細胞類型和表達組織的特異性特征。利用原代細胞培養(yǎng)做各種實驗，如藥物測試、細胞分化及病毒學方面的試驗效果很好。其操作步驟如下。

1、剪切組織：先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用鑷去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后，用刀將組織切成若干小塊，移入青霉素小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪，反復剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm3大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當?shù)木彌_液再清洗一次。

2、消化分離：消化分離的目的是將細小的組織塊消化分離成細胞團或分散的單個細胞，以利于進一步的培養(yǎng)，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。

3、培養(yǎng)：細胞懸液用計數(shù)板進行細胞計數(shù)。用培養(yǎng)液將細胞數(shù)調(diào)整為（2～5）×105 cells／ml，或?qū)嶒炈杳芏?，分裝于培養(yǎng)瓶中，使細胞懸液的量以覆蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜。置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5％CO2，37℃靜置培養(yǎng)。一般3～5d，原代培養(yǎng)細胞可以黏附于瓶壁，并伸展開始生長，可補加原培養(yǎng)液量1／2的新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后換液，一般7～14d可以長滿瓶壁，進行傳代。

4、注意事項：

1）無菌操作：細菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的常見原因，必須加強各個環(huán)節(jié)的無菌操作觀念，以預防為主，一旦污染，一般很難消除。

（2）培養(yǎng)液：所用的培養(yǎng)液必須滿足細胞生存和生長的必要條件。由于細胞來源的動物種類、組織類型不同，對培養(yǎng)液的要求有一定的差異，必要時可用預實驗的方法選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)液。

（3）小牛血清：小牛血清對于維持培養(yǎng)細胞的生存和促進細胞增殖起著關(guān)鍵性作用。可選擇多種不同批號的小牛血清進行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號小牛血清后，就保持應用至實驗完成。

（4）膠原酶溶液：必須新鮮配制，貯存時間過長(即使是-20℃低溫保存)，也將影響消化效力，導致消化時間過長，細胞損傷增加。

（5）L-谷氨酰胺：幾乎所有細胞對谷氨酰胺都有較高的要求，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時，細胞會因生長不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱貯存兩周以上時，就應重新加入原來量的谷氨酰胺。

（6）靜置培養(yǎng)：原代細胞在消化分離后，置于CO2培養(yǎng)箱的頭24～48h (必要時72h)內(nèi)，應處于絕對靜置狀態(tài)，切忌不時地取出培養(yǎng)瓶觀察生長狀況，這將使原代分離細胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖，初學者尤應注意。不必擔心培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分會消耗光，在細胞增殖之前對營養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細胞貼壁伸展。

（7）消化時間：一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已經(jīng)松散，略經(jīng)吹打即成細胞團或單個細胞，過久的消化往往導致細胞損傷加重，細胞培養(yǎng)成活率降低。

（8）其他生長因子：經(jīng)過以上處理，一般原代分離細胞培養(yǎng)均可以成功。對于少數(shù)特殊類型細胞也可以考慮加一些特殊的生長因子，如胰島素能促使細胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外，內(nèi)毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費用較高。