3D單細(xì)胞數(shù)字圖譜的分析系統(tǒng)

3D單細(xì)胞數(shù)字圖譜研究時空組織結(jié)構(gòu)測量分析系統(tǒng)

三維（3D）幾何模型不僅是定量表征復(fù)雜組織的強(qiáng)大工具，而且對探測組織中的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系也很有用。然而，由于同時獲取多個（>4）熒光通道的實(shí)驗(yàn)限制，這些模型通常是不完整的。事實(shí)上，肝臟的預(yù)測幾何和功能模型僅限于少數(shù)組織和細(xì)胞成分，不包括重要的細(xì)胞群體，如肝星狀細(xì)胞（HSC）和庫普弗細(xì)胞（KCs）。在這里，我們進(jìn)行了深層組織免疫染色、多光子顯微鏡、深度學(xué)習(xí)技術(shù)和3D圖像處理，以計(jì)算擴(kuò)展同時重建的組織結(jié)構(gòu)的數(shù)量。然后，我們生成了肝臟結(jié)構(gòu)的時空單細(xì)胞圖譜（Hep3D），包括小鼠出生后發(fā)育不同階段的所有主要組織和細(xì)胞成分。我們使用Hep3D定量研究了1）從出生后早期發(fā)育到成年的肝臟形態(tài)動力學(xué)，以及2）KCs在小鼠肝臟穩(wěn)態(tài)中的結(jié)構(gòu)作用。除了對膽管和正弦網(wǎng)絡(luò)重塑的完整描述外，我們的分析還發(fā)現(xiàn)了非實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞在大小、細(xì)胞核數(shù)量和DNA含量方面不同的出乎意料的時空模式。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)KCs的特異性耗竭改變了HSC的數(shù)量和形態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了肝臟異質(zhì)性的新特征，并對肝臟組織的結(jié)構(gòu)組織及其功能具有重要意義。該3D單細(xì)胞圖譜是了解生理和病理?xiàng)l件下肝組織結(jié)構(gòu)的有力工具。

介紹：

肝臟具有廣泛的功能，包括新陳代謝、解毒、蛋白質(zhì)合成和產(chǎn)生有助于消化的生化物質(zhì)。這些不同的功能依賴于復(fù)雜的3D組織結(jié)構(gòu)，不同的細(xì)胞類型以協(xié)調(diào)的方式共存和相互作用，因此，對細(xì)胞的確切空間位置進(jìn)行三角測量是理解其作用的關(guān)鍵。從宏觀上看，肝臟由稱為小葉的功能解剖單元組成，小葉包括位于中央靜脈（CV）和門三聯(lián)體（肝動脈、門靜脈（PV）和膽管）之間的細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)。來自腸道、胰腺和脾臟的血液通過PV進(jìn)入肝臟，并與來自肝動脈的血液混合。然后，血液通過一個稱為血竇的高度分支的血管網(wǎng)絡(luò)流向CV，而膽汁則以反平行的方向流經(jīng)二個膽管（BC）網(wǎng)絡(luò)。中央靜脈和門靜脈之間的空間主要由肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞填充。肝細(xì)胞是肝功能核心的原代細(xì)胞類型，負(fù)責(zé)處理血液和向BC分泌膽汁。它們被“夾"在正弦內(nèi)皮細(xì)胞之間，并與多個相鄰的肝細(xì)胞共享頂端表面，形成3D BC網(wǎng)絡(luò)。這種組織允許肝細(xì)胞與血竇和BC網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行多次接觸，以大限度地交換分子（1）。非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在肝功能和生長調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。它們包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞（HSC）和庫普弗細(xì)胞（KC）。HSC位于竇和肝細(xì)胞之間的Disse間隙，儲存維生素A，并分泌大部分細(xì)胞外基質(zhì)（2）。事實(shí)上，HSC的激活是幾種肝病的核心驅(qū)動因素（2）。KCs是位于正弦毛細(xì)血管內(nèi)的肝臟特異性自我更新常駐巨噬細(xì)胞，在啟動肝臟免疫反應(yīng)和清除循環(huán)內(nèi)毒素方面發(fā)揮重要作用（3）。越來越多的證據(jù)表明，肝細(xì)胞、HSC和內(nèi)皮細(xì)胞密切接觸，從而形成所謂的“肝生態(tài)位。因此，整合在生態(tài)位內(nèi)的任何細(xì)胞的功能變化終都可能影響其鄰域，這并不奇怪。

經(jīng)典組織學(xué)在理解肝臟組織結(jié)構(gòu)方面起著至關(guān)重要的作用。它簡單、通用，而且容易上手。然而，該技術(shù)也存在幾個缺點(diǎn)，1）它不是定量的，2）忽略了3D信息，3）區(qū)分非實(shí)質(zhì)細(xì)胞差，以及4）一些組織結(jié)構(gòu)不可見，例如BC網(wǎng)絡(luò)。組織清除、高分辨率熒光顯微鏡和3D圖像分析的發(fā)展使3D肝組織重建能夠以幾何模型的形式進(jìn)行，以前所wei有的細(xì)節(jié)描述肝組織結(jié)構(gòu)。在過去的幾年里，幾何模型已經(jīng)被證明是游戲規(guī)則的改變者，并闡明了肝組織組織的基本原理。一些主要發(fā)現(xiàn)包括：i）肝細(xì)胞基于其倍性表現(xiàn)出明顯的空間分帶，ii）膽汁動力學(xué)的一個預(yù)測模型，iii）肝細(xì)胞性表現(xiàn)出液晶順序，iv）肝部分切除術(shù)后的肝再生需要生物力學(xué)生長控制，和v）非酒精性脂肪肝患者的人類肝臟活檢的3D重建顯示3D BC網(wǎng)絡(luò)中存在嚴(yán)重的拓?fù)淙毕荩瑢?dǎo)致分帶性微膽汁淤積。

到目前為止，熒光顯微鏡通常被限制為多四個熒光標(biāo)記。由于這一限制，3D幾何模型無法同時描述所有主要細(xì)胞類型和組織結(jié)構(gòu)，從而忽略了肝生態(tài)位的組織。同時重建所有重要的組織網(wǎng)絡(luò)（BC和血竇）、細(xì)胞（肝細(xì)胞、HSC和KCs）和亞細(xì)胞成分（細(xì)胞核）需要至少六種不同的標(biāo)記物，因此不可能同時觀察到所有感興趣的結(jié)構(gòu)，該系統(tǒng)結(jié)合了深層組織免疫染色、光學(xué)清除、多光子顯微鏡、深度學(xué)習(xí)技術(shù)和3D圖像處理，虛擬地?cái)U(kuò)展了標(biāo)記物的數(shù)量，并生成了肝組織的時空3D單細(xì)胞圖譜。我們使用Hep3D來描述出生后早期發(fā)育過程中的形態(tài)學(xué)變化以及KCs在肝組織結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)作用。該圖譜提供了一個強(qiáng)大的工具來定量描述每種細(xì)胞類型、其空間組織及其可能的交叉相互作用。Hep3D將有助于識別肝臟結(jié)構(gòu)的（亞）結(jié)構(gòu)特征，為了解肝臟生物學(xué)和病理學(xué)提供前所wei有的定量工具。

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