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細胞凍存應(yīng)該注意哪些事項？
閱讀：1088 發(fā)布時間：2023-1-51、凍存細胞的效果好壞要看細胞復蘇時的存活率。細胞凍存時，細胞內(nèi)部會產(chǎn)生晶體，水凝固形成的高濃度溶質(zhì)會對細胞產(chǎn)生損傷，所以在凍存過程中要盡可能降低晶體的產(chǎn)生。為了提高復蘇存活率，可通過以下方法完成：
a.降溫的速度不能太快，讓細胞內(nèi)的水分緩慢離開細胞；
b.在低溫環(huán)境下凍存細胞可以降低高濃度鹽對細胞中蛋白質(zhì)的影響；
c.凍存試劑要采用親水的低溫保護劑；
d.復蘇時的速度要快，這樣可以減少細胞內(nèi)部冰晶溶解時產(chǎn)生的某些可溶性成分。
2、凍存細胞是為了留種，所以要選擇高濃度的細胞量進行凍存。正常情況下，當細胞濃度達到1*105/ml時即可凍存，具體是多少量主要根據(jù)個人觀察。
3、二甲基亞砜（DMSO)因為穿透細胞的能力較強，因此作為常用的凍存劑，也可以叫做細胞保護劑加入到細胞懸液中。網(wǎng)上有些分享說道，如果選用DMSO，整個細胞懸液的制作過程都要在4℃環(huán)境下進行。本人采用過這種方法凍存過A549和某一原代細胞，發(fā)現(xiàn)A549復蘇存活率和正常凍存的過程相比并沒有明顯區(qū)別，而原代細胞的接種率確實有所上升，可能是因為是A549細胞比較皮實，這種方法更適用于比較脆弱的細胞吧。
4、凍存液比例一般是培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或5:4:1；動物種屬的原代細胞凍存液可采用的比例是培養(yǎng)基：血清：DMSO=0:9:1，即直接用血清重懸細胞再加入DMSO，盡管如此，原代細胞的復蘇成活率還是很低。
5、有文獻表明，細胞以l℃/min的速度冷凍存活率最髙，因為這一速度可以很好的控制細胞內(nèi)部晶體的產(chǎn)生。我們實際操作不可能將速度控制的這么精確，目前慣用的就是4℃30min、-20℃1h30min、-80℃2h后轉(zhuǎn)入液氮中。
6、正常情況下，經(jīng)過-20℃1h30min這一步后，凍存管內(nèi)的細胞已經(jīng)處于凝固狀態(tài)，如果此時凍存管內(nèi)還是液體，很可能是DMSO或冰箱冷凍功能出現(xiàn)了問題。如若遇到這種情況，不能因為時間到了，就把把液體狀態(tài)的凍存管放置到液氮中，可以適當延長在-20℃環(huán)境下的冷凍時間30-60分鐘，直至凍存液凝固后再放到液氮中。
7、凍存記錄要表明細胞的種類、凍存之前的狀態(tài)和大致數(shù)量、凍存時間和操作者。
8、液氮內(nèi)的細胞凍存最長時間不要超過半年，凍存在液氮中的細胞應(yīng)一段時間內(nèi)進行更替。一個細胞系在培養(yǎng)一個月后，可復蘇一管新的細胞確保其質(zhì)量沒有發(fā)生太大變化，傳代幾次后，再凍存留種。
9、細胞復蘇時，為保證獲得較高的存活率和接種率，應(yīng)盡可能的快速完成復蘇，以避免在升溫過程中細胞內(nèi)部晶體的產(chǎn)生。書面介紹的復蘇溫度是37℃-42℃，但是本人在實際操作中發(fā)現(xiàn)40℃環(huán)境下復蘇。
10、復蘇時的凍存管一定要密封好，以免管內(nèi)外溫度和壓力不同導致凍存管炸裂。
11、復蘇時使用的培養(yǎng)基和凍存時使用的培養(yǎng)基中的血清盡量保證同一批次。
12、DMSO快速稀釋會對細胞造成滲透性損傷，使存活率下降50%。對于DMSO凍存的細胞，復蘇后應(yīng)緩慢稀釋成細胞懸液：
1.凍存液：培養(yǎng)基=1:1稀釋成細胞懸液后離心，然后重懸至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，隔天換液。
2.凍存液：培養(yǎng)基=1:10稀釋成細胞懸液，不用離心，直接放置到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2-4小時后，換液。上述兩種方法都是比較常用的細胞復蘇方法，后者更適用于原代細胞或比較難養(yǎng)的細胞。