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禽流感病毒H7亞型檢測試劑盒
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，定性檢測禽流感病毒H7亞型，對禽流感病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。
產(chǎn)品簡介
詳細(xì)介紹
禽流感病毒H7亞型檢測試劑盒
【包裝規(guī)格】 25頭份/盒 & 50頭份/盒
【預(yù)期用途】
禽流感病毒H7亞型檢測試劑盒
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，定性檢測禽流感病毒H7亞型，對禽流感病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對禽流感病毒H7亞型基因組高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含禽流感病毒H7亞型基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析禽流感病毒H7亞型檢測試劑盒。
注：陰性對照為禽類基因組DNA，陽性對照為失去活性的禽流感病毒H7亞型cDNA。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.取咽喉拭子、泄殖腔拭子或血液樣本，禽肉取肌肉或內(nèi)臟樣本，樣本處理方法參照相關(guān)文獻(xiàn)資料。
2.樣本采集后應(yīng)立即檢測，若不能立即檢測，應(yīng)置于-80℃冷凍保存，避免反復(fù)凍融，用干冰或液氮運(yùn)輸。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | RT-PCR反應(yīng)液 | 15.0 μL |
逆轉(zhuǎn)錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集禽流感病毒H7亞型熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號） |
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
+ | 標(biāo)本中檢出禽流感病毒H7亞型RNA |
- | 標(biāo)本中未檢出禽流感病毒H7亞型RNA |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的*檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的*檢出限為102 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。