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基于二氧化鈦富集策略的人類 磷酸化蛋白質(zhì)組大規(guī)模鑒定
閱讀：319 發(fā)布時(shí)間：2019-4-14| 提 供 商 | 上海斯邁歐分析儀器有限公司 | 資料大小 | 2.1MB |
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蛋白質(zhì)磷酸化是一種非常重要的翻譯后修飾，其在細(xì)胞周 期、細(xì)胞增殖分化、代謝和凋亡等各個(gè)生物學(xué)過程中都起 到了重要的調(diào)控作用。在真核生物中，約有 1/3 的蛋白質(zhì) 處于其磷酸化狀態(tài)，不同的蛋白質(zhì)其磷酸化水平差異很大， 從低于 1% 到高達(dá) 90% 不等[1]。
磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)面臨著諸多技術(shù)挑戰(zhàn)，如：磷酸化蛋白 質(zhì)豐度較低且動(dòng)態(tài)范圍大，磷酸化肽段的離子化效率相 對(duì)偏低，磷酸修飾基團(tuán)的具體位置難以確定，等等。在 目前的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，通常都需要在質(zhì)譜分 析前對(duì)樣品中的磷酸化肽段進(jìn)行富集，以消除非修飾肽 段對(duì)于磷酸化肽段的鑒定抑制[2]。磷酸化肽段的富集方法 主要包括固定化金屬親和色譜（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC）[3]，二氧化鈦（Titanium dioxide, TiO2）[4] 以及基于抗體的富集方法[5]。其中二氧化鈦方法有 著富集效率高，簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)勢(shì)，從而成為了目前廣 泛使用的富集方法。為了進(jìn)一步增加磷酸化位點(diǎn)的鑒定深 度，通常需要對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行預(yù)分級(jí)，包括采用離子 交換色譜[6]，高 pH 反相色譜[7]，親水相互作用色譜[8]，以 及 TiO2 多次富集[9] 等方法。在這部分工作中，我們采用 TiO2 富集結(jié)合多種肽段預(yù)分級(jí)的策略，通過 Orbitrap 采 集 HCD 產(chǎn)生的二級(jí)碎片離子，并終使用 MaxQuant 的 PTM score 系統(tǒng)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的確認(rèn)，從而得到了高達(dá) 40,000 個(gè)位點(diǎn)的 Hela 細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組深度覆蓋。
Hela 細(xì)胞用 SDT 裂解液裂解，并用 FASP 方法酶解[10]。 TiO2 富集磷酸化肽段的方法參考文獻(xiàn)[9]。肽段高 pH 反相 色譜預(yù)分級(jí)的方法參考文獻(xiàn)[7]。磷酸化肽段 SCX 分級(jí)的 方法參考文獻(xiàn)[11]。
色譜條件：液相色譜儀：Easy nLC 1200（ThermoFisher Scientific）