單細(xì)胞測序的難點(diǎn)在于如何把不同類型的組織解離成單細(xì)胞懸液。目前，主要的單細(xì)胞分離方法有口吸法、顯微操作法、流式細(xì)胞法、微流控。
顯微操作法是一種能夠直接觀察到單細(xì)胞分離的方法。這一方法能夠準(zhǔn)確控制單個(gè)細(xì)胞的吸取與釋放，但是對實(shí)驗(yàn)操作的要求較高，不利于規(guī)?；僮?，F(xiàn)ACS則能夠大規(guī)模獲得單細(xì)胞樣本，該方法是利用流式細(xì)胞儀，借助于細(xì)胞表面標(biāo)記分選出特定群體的細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞。
雖然這一方法需要專門的設(shè)備，且細(xì)胞的消化和分選過程會對細(xì)胞狀態(tài)產(chǎn)生一定的影響，但是該方法的效率和準(zhǔn)確率較高，標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，有利于不同實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)研究的比較，而流式和微流控的方法可以適用于大規(guī)模分離單細(xì)胞懸液，而大規(guī)模分離單細(xì)胞首先需要制備細(xì)胞活力較高的細(xì)胞懸液。
懸液制備和質(zhì)控中的注意事項(xiàng)：
1、組織樣本制備懸液時(shí)間不超過4h；
2、單細(xì)胞分離懸液中不能含有Ca2+和Mg2+，且不能含有Tween80之類的表面活性劑，否則會影響細(xì)胞活性；
3、根據(jù)項(xiàng)目的情況選擇合適尺寸的細(xì)胞篩。細(xì)胞尺寸可選20~40μm不等，目的是濾掉雜質(zhì)和細(xì)胞團(tuán)；
4、解離好的細(xì)胞懸液武漢樣本庫技術(shù)服務(wù)平臺推薦細(xì)胞活率為85%以上，低于75%不能上機(jī)；
5、細(xì)胞懸液的適宜濃度700-1200cells/μL。濃度過高，上樣體積太小，誤差太大；濃度太低，體積太大，會帶入一些雜質(zhì)和細(xì)胞團(tuán)等；
6、細(xì)胞懸液制備完成后要盡快建庫，樣本制備好到上機(jī)的時(shí)間間隔不宜超30min。不能保證同時(shí)制備多個(gè)樣本的細(xì)胞懸液時(shí)，可能導(dǎo)致各樣本之間懸液制備間隔時(shí)間過長，此時(shí)則不建議一次完成多樣本建庫。
