蛋白酶k配制、使用方法及作用

      蛋白酶k（Proteinase K）是一種枯草蛋白酶類(lèi)的高活性蛋白酶，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解?？梢杂糜谙鞣N蛋白。用于各種常見(jiàn)的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)，例如基因組DNA抽提、酶的消化去除等。
     酶活力，>30U/mg。在37℃，以血紅蛋白為底物，1分鐘內(nèi)可以產(chǎn)生相當(dāng)于1微摩爾酪氨酸Folin陽(yáng)性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定義為一個(gè)單位蛋白酶K酶活力。
在很寬的pH范圍內(nèi)有效，有效的pH范圍為pH4.0-12.5，較好在pH范圍為pH7.5-8.0。
蛋白酶K的較好反應(yīng)溫度為65℃，但在65℃或更高的溫度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。很多時(shí)候反應(yīng)溫度選擇50-55℃。
    在0.2-1%SDS或約10mM尿素存在的情況下，蛋白酶K顯示更高的酶活性。蛋白酶K的常用工作濃度為0.05-1mg/ml，根據(jù)所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH是否適合、溫度是否適合等因素確定具體的工作濃度。
    蛋白酶K跟蛋白酶有什么區(qū)別：
蛋白酶K廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué),藥理學(xué)等科研方面.一種非特異性、枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶,具有很高的比活性.一般儲(chǔ)存在-20°C,避光防潮密閉干燥。
蛋白酶是所有能夠催化分解蛋白質(zhì)的酶類(lèi)的統(tǒng)稱,而蛋白酶K則是特指一種枯草蛋白酶類(lèi)的高活性蛋白酶,用于生物樣品中蛋白質(zhì)的降解,比如在提取DNA時(shí)溶解DNA的水中就有一定量的蛋白酶K.所以它們不屬于同一個(gè)產(chǎn)品。
     蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)：20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)(proteinase K)：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。
   蛋白酶K的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。
孵育溫度為5565℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時(shí)間為15分鐘48小時(shí);理想孵育時(shí)間為2小時(shí)。
作用：蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用，以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)，提高雜交信號(hào).但蛋白酶K的濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高時(shí)，都會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，導(dǎo)致組織切片的脫落，細(xì)胞核?的消失，從而影響雜交結(jié)果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現(xiàn)的問(wèn)題，并能達(dá)到理想的染色效果。
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