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2023-12-19 閱讀(851)
臺(tái)盼藍(lán)染液是細(xì)胞活性染料,常用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性。細(xì)胞損傷或死亡時(shí),臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜,與解體的DNA結(jié)合,使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以檢測(cè)細(xì)胞是否存活。
臺(tái)盼藍(lán)染色法的原理
正常的活細(xì)胞,胞膜結(jié)構(gòu)完整,能夠排斥臺(tái)盼藍(lán),使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi);而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞,胞膜的通透性增加,可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失,即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡,這與中性紅作用相反。
因此,借助臺(tái)盼藍(lán)染色可以非常簡(jiǎn)便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。
注意凋亡小體也有臺(tái)盼藍(lán)拒染現(xiàn)象。臺(tái)盼藍(lán)染色后,通過(guò)顯微鏡下直接計(jì)數(shù)或顯微鏡下拍照后計(jì)數(shù),就可以對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行比較精確的定量。
實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 用Hanks液配制0.1%臺(tái)盼藍(lán)溶液;
2. 用0.5%胰蛋白酶:0.2%EDTA=1:1混合液來(lái)消化培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞;
3. 再加入適量Hanks液制成細(xì)胞懸液;
4. 將待染色細(xì)胞稀釋至所需濃度(方法及濃度范圍與細(xì)胞計(jì)數(shù)相同);
5. 每0.1ml細(xì)胞懸液約加新鮮配制的染液一小滴,室溫下染3—5min;
6. 染色過(guò)的細(xì)胞材料,取一滴細(xì)胞懸液置玻片上,加蓋玻片后放高倍鏡下觀察;
7. 死亡的細(xì)胞著淺藍(lán)色并膨大,無(wú)光澤。活細(xì)胞不著色并保持正常形態(tài),有光澤;
8. 計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)目;
9. 統(tǒng)計(jì)未染色細(xì)胞??砂垂接?jì)算出細(xì)胞活率。
細(xì)胞活率(%)=未染色的細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)×100。
MTT染色原理,與臺(tái)盼藍(lán)染色原理有類似之處
活細(xì)胞中的某些物質(zhì)(線粒體中的琥珀酸脫氫酶)能夠和MTT反應(yīng),使MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞沒(méi)有此功能。DMSO(二甲基亞砜)能夠?qū)⒋私Y(jié)晶(藍(lán)紫色甲瓚)溶解,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值,能夠間接的反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量。一定范圍內(nèi),藍(lán)紫色結(jié)晶沉淀的數(shù)量與細(xì)胞數(shù)成正比。目前MTT法因其靈敏度高,經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)勢(shì)被廣泛的運(yùn)用于細(xì)胞毒性試驗(yàn),腫瘤藥物的篩選、放射敏感性測(cè)定和對(duì)某些生物活性因子的活性檢測(cè)(原核真核蛋白表達(dá))等方面。對(duì)細(xì)胞活力有影響的表達(dá)蛋白活性檢測(cè)可以通過(guò)MTT比色法進(jìn)行。