CdSe/ZnS量子點在納米藥物研究中的應用
量子點諸多光學優(yōu)點使其廣泛應用于細胞標記、組織成像、腫瘤識別等生命科學領(lǐng)域。量子點在生物標記中取得的成功促使藥物研發(fā)人員將其應用于納米藥物的熒光成像研究。由于納米藥物粒度尺寸小，組成材料和結(jié)構(gòu)復雜，其藥效評價方法 和分析技術(shù)手段必將與其原形藥物存在明顯差異。以體內(nèi)藥物分析中經(jīng)典的色譜分析技術(shù)進行納米藥物靶向效率、藥效評價以及體內(nèi)行為研究，不僅操作繁瑣，耗資巨大，而且效率較低。熒光成像技術(shù)的發(fā)展為藥物活體研究提供了新的技術(shù)平臺和發(fā)展機遇。目前人們可以應用激光共聚焦顯微鏡和近紅外成像系統(tǒng)分別實現(xiàn)細胞和活體水平的熒光信號檢測。而量子點具有熒光效率高、抗光漂白能力強等優(yōu)勢，將其與熒光成像的方法相結(jié)合，則能夠?qū)崟r動態(tài)監(jiān)測納米藥物在活體細胞或動物體內(nèi)的行為，并且響應速度快，便于長時間連續(xù)觀察。熒光量子點的應用有助于直觀、快速、準確地獲取納米藥物在生物體內(nèi)分布、轉(zhuǎn)運、釋放和藥效機理等重要信息，為設(shè)計和開發(fā)臨床用納米藥物提供技術(shù)支持。
1、 量子點納米藥物載體
量子點的表面修飾技術(shù)已經(jīng)比較成熟，表面配體為巰基乙酸、 巰基乙胺或聚乙二醇（PEG）等聚合物的水溶性量子點能夠以靜電結(jié)合或共價結(jié)合的方式和藥物分子偶聯(lián)，形成以量子點為載體的納米藥物復合物，進而實現(xiàn)藥物分子在細胞或動物體內(nèi)的熒光示蹤研究。
量子點標記抗高血壓藥物卡托普利（Cap），分析其在小鼠體內(nèi)的藥物動力學和代謝過程。他們利用Cap分子中巰基和量子點的強配位作用，將脂溶性量子點表面的TOPO配體置換，形成QDs-Cap復合物。實驗結(jié)果顯示復合物也表現(xiàn)出和Cap 類似的降壓作用?；铙w成像的熒光信號顯示復合物終主要在肝臟、肺和脾臟蓄積。盡管起藥效的是復合物還是Cap分子等問題尚需進一步驗證，但這一工作為小分子藥物的體內(nèi)研究提供了新的思路。通過活體熒光成像的方法評價表皮細胞生長因子（EGF）的腫瘤靶向特性和體內(nèi)動力學。將近紅外量子點和EGF共價相連，形成EGF-QDs納米熒光探針。小鼠尾靜注給藥后，活體近紅外熒光成像顯示EGF-QDs具有 腫瘤內(nèi)流（約3 min）、清除（約60 min）和蓄積（1-6h）三個特定時相，24 h后腫瘤 熒光下降至基線水平。離體臟器的近紅外熒光和腫瘤組織切片共聚焦顯微鏡分析也證實 其腫瘤特異性蓄積特性。
RNA干擾技術(shù)可以通過沉默基因來阻礙特定蛋白的合成，從而達到疾病治療的效果。以量子點作為納米載體，將腫瘤靶向F3多肽和siRNA分子同時標記在量子點表面，實現(xiàn)了siRNA的腫瘤細胞靶向運送和熒光示蹤。量子點作為siRNA載體，除起到熒光示蹤作用外，藥物療效也得到明顯的改善。他們在量子點表面修飾帶有叔胺結(jié)構(gòu)的復合物，形成帶正電的“質(zhì)子海綿”，從而可以和siRNA通過 靜電作用結(jié)合。實驗中通過熒光信號跟蹤復合物進入細胞膜、內(nèi)涵體中解離、釋放到細胞質(zhì)等復雜步驟。研究證實，應用該技術(shù)向MDA-MB-231細胞內(nèi)導入siRNA的效率是現(xiàn)有常規(guī)方法的10至20倍，而毒性則下降了5至6倍。
2、 納米藥物載體的量子點標記
新型納米藥物載體的研發(fā)是納米藥物研究的一個重要組成部分。由于這類開發(fā)是針對藥理和藥效基本明確的藥物，通過載體或劑型的改進達到提高療效的目的，因此風險小、見效快，是目前納米藥物研究領(lǐng)域為活躍的一個方向。在生物標記的研究中，為了提高量子點的標記靶向性和生物相容性，科研人員選擇多種生物材料作為包覆物制備成包裹量子點的脂質(zhì)體、乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米球、聚 D,L-乳酸（PLA）納米球等（見表），為納米藥物載體的量子點標記方法研究奠定了基礎(chǔ)。
⑴ 脂質(zhì)體
用表面為 TOPO 的脂溶性 CdSe/ZnS 量子點標記了兩性離子甘油-3-磷脂酰膽堿（DOPC）和陽離子1,2-二油酰-3-*銨基丙烷（DOTAP）小單層脂質(zhì)體（圖A）。低溫透射電鏡（cryo-TEM）顯示量子點通過疏水作用自組裝嵌入到脂質(zhì)體磷脂雙層膜內(nèi)。通過共聚焦顯微鏡觀察到兩種脂質(zhì)體可以結(jié)合在人肺上皮細胞表面并被其內(nèi)吞。進一步將脂質(zhì)體注射到活體種植的人宮頸 T 癌T 腫瘤內(nèi)，組織切片熒光表明陽離子 DOTAP 脂質(zhì)體 T 的腫瘤攝取和保留明顯強于 TDOPC 脂質(zhì)體。另外一個工作以相似的手 段考察了不同磷脂組成脂質(zhì)體的細胞靶向性差異。 分別制備了磷脂膜量子點熒光標記的TDOTAP∶二豆冠酰磷脂酰 T 膽堿（TDMPC）（25∶75）和 DOTAP∶二棕櫚酸磷脂酰乙醇胺（DPPE）-PEG2000∶DMPC（25∶0.5∶74.5）的陽離子小單層脂質(zhì)體，進行 HEK293 細胞標記研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)種脂質(zhì)體幾秒鐘就被細胞內(nèi)吞進入細胞質(zhì)，而第二種則選擇 性的標記細胞膜，共培養(yǎng) 1 h 后細胞質(zhì)中也沒有檢測出熒光。
在脂質(zhì)體膜外表面共價連接量子點“熒光天線”的方法標記免疫脂質(zhì)體。首先制備含有末端氨基修飾的PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（NH2-PEG-DSPE）的阿霉素載藥脂質(zhì)體，然后選擇表面為羧基的水溶性CdSe/ZnS量子點作為熒光探針，HER2（人表皮生長因子受體2）作為靶向修飾分子，分別和NH2-PEG-DSPE的氨基共價連接，形成量子點標記免疫脂質(zhì)體（量子點ILs）（圖B）。共聚焦顯微鏡和流式細胞檢測均證實該量子點ILs對HER2過度表達的SK-BR-3和MCF-7/HER2細胞的靶向特性。腫瘤種植裸鼠靜脈給藥量子點ILs后，通過熒光成像系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)熒光信號主要分布在單核巨噬細胞T系統(tǒng)和腫瘤部位，T證實該載藥體系具有活體靶向治療作用。
⑵殼聚糖納米球
量子點熒光標記殼聚糖納米藥物載體方向的研究。他們利用水溶性無機納米材料和殼聚糖之間的強靜電作用，成功制備了量子點-（Gd-DTPA）熒光-磁性雙功能標記以及多色量子點標記的殼聚糖納米球。近該小組制備了量子點標記殼聚糖納米粒子作為HER2/neu siRNA的載體（圖C），并通過跟蹤量子點的熒光信號證實藥物載體靶向傳送到SKBR3乳腺腫瘤細胞，用熒光素酶和酶聯(lián)免疫分析驗證導入細胞的siRNA的基因沉默效應。這種量子點熒光示蹤的方法將有助于為今后開發(fā)、篩選siRNA殼聚糖納米藥物載體，研究其體內(nèi)藥理特性。
⑶碳納米管
碳納米管（CNT）具有高純度和尺寸一致等優(yōu)點，對人體毒性較小，在結(jié)構(gòu)上表面積 大，能攜帶大量藥物，并具有藥物緩釋特性，是諸多種類納米藥物載體中的一支新秀。近來也有工作將CNT和量子點這兩種無機納米材料結(jié)合開發(fā)納米藥物并應用于活體研究。
首先用CdTe量子點共價標記基因治療藥物反義寡核苷酸（ASODNs），并借助聚乙烯亞胺 （PEI）陽離子聚合電解質(zhì)修飾羧基化的多壁碳納米管（MWNT），然后將ASODNs-量子點和功能化的MWNT以靜電作用方式結(jié)合，形成熒光標記的碳納米管載藥系統(tǒng)（圖D）。實驗通過共聚焦熒光成像等手段比較了PEI修飾前后MWNT對HeLa的細胞毒性和ASODNs輸送效率，發(fā)現(xiàn)羧基化MWNT在經(jīng)過聚合物修飾后毒性降低，而細胞核靶向傳送藥物的效率明顯提高。
采用直接用量子點標記MWCNT的方法研究其在動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運分布行為。他們將外壁表面羧基化的MWCNT和表面氨基修飾、發(fā)射波長為610 nm的CdSe/ZnS量子點偶聯(lián)生成MWCNTs-量子點納米藥物載體。將MWCNTs-量子點皮下注射至裸鼠背部和腹部，通過活體熒光監(jiān)測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)明顯的熒光信號。進一步選擇發(fā)射波長更長的近紅外 CdSeTe/ZnS量子點，以相同的方式標記MWCNT，并在空腔內(nèi)裝載抗腫瘤藥物紫杉醇（圖E）。將該復合體系通過尾靜脈注射至裸鼠體內(nèi)，經(jīng)過6天的循環(huán)代謝，近紅外活體 成像發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟、胃和小腸部位顯示明亮熒光，表明CNT納米藥物載體主要在這些臟 器分布蓄積，與通過ICP-MS測定組織內(nèi)鎘元素含量的結(jié)果相吻合。
3、 納米藥物釋放研究
傳統(tǒng)考察納米藥物生物體內(nèi)釋放的方法主要是通過HPLC-MS等手段測定藥物的總含 量，在實際工作中這類方法往往存在問題。例如，難以對游離藥物和包封藥物分別定量；在生物體內(nèi)復雜背景下，對某些檢測響應差或痕量藥物的定量也存在技術(shù)困難。前述的基于量子點熒光共振能量轉(zhuǎn)移（QDs-FRET）方法不僅在納米傳感器設(shè)計等領(lǐng)域得到了成功應用，近來在納米藥物生物體釋放的研究中也取得一定的進展。
在基因納米藥物開發(fā)中，多聚物-核酸復合物用于基因運載的關(guān)鍵是在目標細胞DNA能適時地從復合物中卸載，實現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)移。這一過程控速步驟的機理闡釋一直是一個難題。借助QDs-FRET方法對這一問題進行研究。將質(zhì)粒DNA（plasmidDNA）和殼聚糖基因載體分別標記量子點和Cy5染料，組成FRET的供受體對。在復合物未解離時，量子點和Cy5的距離很近，二者可以進行有效的FRET，造成Cy5熒光信號增強。 隨著復合物中DNA的釋放，量子點和Cy5間FRET現(xiàn)象消失，導致量子點熒光增強而Cy5信號 明顯下降（圖11）?；诹孔狱c FRET信號可以靈敏地檢測復合物穩(wěn)定性的變化；借助激光共聚焦顯微鏡便可以實時獲取復合物在細胞內(nèi)攝取和DNA解離釋放信息。 通過圖像定量分析發(fā)現(xiàn)在溶酶體、細胞漿及細胞核三區(qū)室質(zhì)粒DNA釋放符合一級動力學模型。該課題組通過相同的手段又比較了殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚磷酸酯作為基因載體的解離動力學，獲取結(jié)果與實際轉(zhuǎn)染效率得到了很好的吻合。用FRET手段分析不同相對分子質(zhì)量的殼聚糖-質(zhì)粒DNA復合物的解離情況， 質(zhì)粒DNA和聚合物載體分別用量子點和德克薩斯紅染料標記。實驗發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖摩爾質(zhì)量增大，HEK29細胞中德克薩斯紅標記殼聚糖的熒光逐漸下降，表明所形成復合物的解離程度更加明顯。另外用熒光光譜監(jiān)測復合物在pH 7.4和pH 5.0條件下熒光的變化情況，結(jié)果證實殼聚糖/DNA復合物的解離主要在酸性條件下發(fā)生。
雙FRET體系（Bi-FRETsystem）用于量子點裝載抗腫瘤藥物阿霉素（Dox）在細胞內(nèi)的釋放研究（圖12）。首先將量子點表面包覆可以識別特異性前列腺膜抗原的A10 RNA核酸適體（Apt），然后和阿霉素溶液混合，使阿霉素內(nèi)插至核酸適 體的雙鏈，形成[QDs-Apt（Dox）]復合物。藥物扦插作用形成量子點和阿霉素組成的供體-受體對以及阿霉素和核酸適體組成的供體-猝滅體對雙FRET體系，導致了復合物可逆性熒光自猝滅。復合物被前列腺腫瘤細胞識別和攝取后，隨著溫孵時間的延長，阿霉素從復合物中釋放，細胞內(nèi)量子點和阿霉素的熒光信號均明顯上升，通過測定熒光信號變化，同時實現(xiàn)了腫瘤細胞定位和細胞內(nèi)阿霉素釋放檢測。
應該注意的是目前應用量子點FRET方法研究藥物動態(tài)釋放的工作都僅局限在細胞層次，活體動物研究尚未見報道，主要原因是量子點近紅外活體成像的應用還處于起步階段，諸如近紅外量子點體內(nèi)性質(zhì)和基于圖像信號的定量方法等問題的研究還需要深入完善。相信隨著近紅外量子點和近紅外成像技術(shù)的發(fā)展和成熟，量子點FRET方法也必將在活體動物體內(nèi)藥物釋放研究中發(fā)揮重要作用。
杭州新喬生物科技有限公司是國內(nèi)的的納米靶向試劑及材料供應商，2017年我公司實驗室新開發(fā)上市熒光量子點系列產(chǎn)品（Fluorescent Quantum Dot），我們可以提供4種不同核殼型的熒光量子包括有：CdSe/ZnS硒化鎘-硫化鋅量子點 ，CdS/ZnS硫化鎘-硫化鋅熒光量子點，InP/ZnS磷化銦-硫化鋅熒光量子點，ZnSe/ZnS硒化鋅-硫化鋅熒光量子點四種。同時我們還提供不同表面配體的核殼型熒光量子點產(chǎn)品包括有：十八胺、alkyl、油酸、氨基和羧基。我們的Fluorescentnanocrystals產(chǎn)品還包括脂溶性的和水溶性的，水溶性的是通過外圍包裹一層聚乙二醇PEG而實現(xiàn)水溶性的，表面可以修飾氨基和羧基。
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