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操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標準品孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μL，標準品孔分別加入依次梯度稀釋標準品，待測樣品孔加待測樣品100μL，給酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。立即每孔加入配好的生物素標記的抗IL-6蛋白抗體工作液100μL（在使用前15 分鐘內(nèi)配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

3.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干；

4.立即每孔加入配好的鏈霉親和素HRP工作液100μL（在使用前15分鐘內(nèi)配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育45分鐘;

5.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干；

6.每孔加TMB底物溶液(TMB)100μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止）。

7.每孔加終止液100μL，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。

8.立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD值）。應(yīng)提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設(shè)置好檢測程序。

9.實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結(jié)束。

注意事項：

1.保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2.酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。暫時不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！

3.加樣：加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間最好控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復孔。

4.溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態(tài)；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

5.洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數(shù)。

6.顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免顏色過深影響酶標儀讀數(shù)。

7.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

8.混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

9.安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品時，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。

10.不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）

11.試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結(jié)果！