人窖蛋白（Cav-1）Elisa試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法（Sandwich ELISA）檢測樣品中靶蛋白的的濃度，其原理見圖2。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標準品或樣品時，其中的靶蛋白會與捕獲抗體結(jié)合。當加入生物素化的抗靶蛋白抗體后，生物素化抗靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合，形成夾心的免疫復合物

人窖蛋白(Cav-1)Elisa試劑盒技術(shù)基本原理  

       ELISA技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

 人窖蛋白(Cav-1)Elisa試劑盒技術(shù)基本類型

       ELISA技術(shù)可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：
（1）固相化的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；

（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；

（3）酶反應的底物。

    根據(jù)人窖蛋白(Cav-1)Elisa試劑盒的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。以下主要介紹幾種公司常用的檢測抗原的類型：

1、間接競爭法測抗原
樣本中的待測藥物和固相化的抗原共同競爭一定量的抗體，加入酶標記抗抗體（酶標二抗）后能與固相化的抗原抗體復合物特異性結(jié)合，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥物含量愈高，競爭結(jié)合的抗體量愈多，從而結(jié)合在固相上的酶標記抗抗體（酶標二抗）量愈少，zui后的顯色也愈淺。本公司及國內(nèi)產(chǎn)品多用此法。具體操作步驟如下：

1）抗原固相化：將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

2）加入標準品/樣本，再加入抗體，保溫反應。樣本中藥物與固相抗原同時競爭與特異性抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結(jié)合不緊密的物質(zhì)。
3）加酶標抗抗體，固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結(jié)合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢藥物的量負相關(guān)。
4）加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測分析，測知樣本中抗原的量。

2、直接競爭法測抗原
（1）直接競爭酶標抗原法測抗原

     樣本中的待測藥物和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥物含量愈高，結(jié)合在固相上的酶標抗原量愈少，zui后的顯色也愈淺。

     （2）直接競爭酶標抗體法測抗原

    樣本中的待測藥物和固相抗原競爭結(jié)合一定量的酶標記抗體，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥物含量愈高，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，zui后顯色也愈淺。

     人窖蛋白(Cav-1)Elisa試劑盒直接競爭法具體操作步驟如下：

1）抗原（或抗體）的固相化：將特異性抗原（或抗體）與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原（或抗體），洗滌除去未結(jié)合的抗原（或抗體）及雜質(zhì)。

2）加入標準品/樣本，再加入酶標抗體（或酶標抗原），保溫反應。樣本中藥物與固相抗原（或酶標抗原）同時競爭與特異性抗體（或固相抗體）結(jié)合，形成固相抗原-酶標抗體復合物（或抗體-酶標抗原復合物）。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結(jié)合不緊密的物質(zhì)。
3）加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測分析，測知樣本中抗原的量。

本公司目前正致力于研究酶標記抗原和酶標記抗體直接競爭法測定抗原，國外大部分ELISA試劑盒均采用此類型。

3、雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2） 加受檢樣本，保溫反應，樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物，洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3） 加酶標抗體，保溫反應，固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合，*洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān)。
4） 加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測分析，測知樣本中抗原的量。
在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體zui分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢樣本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。
在一步法測定中，當樣本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定樣本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可
用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型
問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應
性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應。采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標。
人窖蛋白(Cav-1)Elisa試劑盒雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。