肺炎鏈球菌PCR檢測試劑盒技術(shù)概論
聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。
PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
標準的PCR反應(yīng)體系：
　　　10×擴增緩沖液 　 10ul
　　　4種dNTP混合物 　 各200umol/L
　　　引物 　　　　　 各10～100pmol　
　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　
　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　
　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L
　　　加雙或三蒸水至　 100ul
PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
　　引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
　?、僖镩L度： 15-30bp，常用為20bp左右。
　?、谝飻U增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
　?、垡飰A基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
　?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
　?、菀?’端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
　　⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列zui有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
　　⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
肺炎鏈球菌PCR檢測試劑盒使用及效果

CR反應(yīng)特點
(1) 特異性強

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
　　?、僖锱c模板DNA特異正確的結(jié)合；
　　?、趬A基配對原則；
　　?、跿aq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；
　　?、馨谢虻奶禺愋耘c保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中zui小檢出率為3個細菌。
(3) 簡便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
(4) 對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活PCR技術(shù)概論

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。
組織等粗制的DNA擴增檢測。

對照試驗
　1.陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)，但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。
　2.陰性對照:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。
　3.重復(fù)性試驗
4.選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增
防止污染的方法
(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴格分開。zui能劃分①標本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實驗用品及吸樣槍應(yīng)，實驗前應(yīng)將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。
(五)設(shè)立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的zui低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。
(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。
(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

C0201    胰酶細胞消化液    100ml
C0203    胰酶細胞消化液(含酚紅)    100ml
C0212    L-Glutamine(100X)    100ml
C0218    Hanks' Balanced Salt Solution    500ml
C0219    Hanks' Balanced Salt Solution(with Ca2+ & Mg2+)    500ml
C0220    7.5% NaHCO?溶液    100ml
C0221A    PBS    500ml
C0221D    D-PBS    500ml
C0221G    D-PBS(with Ca2+ & Mg2+)    500ml
C0205    胰酶細胞消化液(不含EDTA)    100ml
C0207    胰酶細胞消化液(含酚紅, 不含EDTA)    100ml
C0210    細胞凍存液    50ml
C0222    青霉素-鏈霉素溶液(100X)    100ml
C0225    胎牛血清(AusgeneX原裝, 優(yōu)級)    500ml
C0227    胎牛血清(AusgeneX原裝, 特級)    500ml
C0228    新生牛血清(AusgeneX原裝, 產(chǎn)地澳洲)    500ml
C0230    胎牛血清(Bovogen原裝, 產(chǎn)地南美)    500ml
C0232    胎牛血清(Gibco原裝, 產(chǎn)地南美)    500ml
C0234    胎牛血清(Gibco分裝, 產(chǎn)地澳洲)    50ml
C0235    胎牛血清(Gibco原裝, 產(chǎn)地澳洲)    500ml
C0246    馬血清(Gibco原裝, 產(chǎn)地新西蘭)    500ml
C0251    胎牛血清(產(chǎn)地南美)    50ml
C0252    胎牛血清(產(chǎn)地南美)    500ml
C0256    胎牛血清(產(chǎn)地澳洲)    50ml
C0257    胎牛血清(產(chǎn)地澳洲)    500ml
C0258    新生牛血清(產(chǎn)地新西蘭)    50ml
C0262    馬血清(產(chǎn)地新西蘭)    50ml
C0265    山羊血清    50ml
C0296    支原體染色檢測試劑盒    >100次
C0312    Poly-D-lysine溶液    2mg
C0313    Poly-L-lysine溶液    5mg
C0288S    支原體清除試劑    20mg
C0288M    支原體清除試劑    100mg
C0290S    支原體清除試劑Plus    10mg
C0290M    支原體清除試劑Plus    50mg
FBX081    81孔液氮罐凍存盒    1個/包
FBX082    100孔液氮罐凍存盒    1個/包
FCFC012    BeyoCool™細胞凍存盒    1個
FGL36L    BeyoGold™獨立包裝無菌無粉乳膠手套(大號)    30副/盒，20盒/箱
FGL36M    BeyoGold™獨立包裝無菌無粉乳膠手套(中號)    30副/盒，20盒/箱