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腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成模型實驗
閱讀：488 發(fā)布時間：2019-2-26| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.4KB |
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| 資料類型 | PNG 圖片 | 瀏覽次數(shù) | 488次 |
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實驗方法原理
無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子，誘導(dǎo)血管生成。
實驗材料 腫瘤細(xì)胞
試劑、試劑盒 DEM藻酸鈉NaClEDTACaCl2臺盼藍(lán)甲醛
儀器、耗材 離心機分光光度計γ計數(shù)儀
實驗步驟
1. 用DEM培養(yǎng)液洗滌對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，收集并重新懸浮細(xì)胞于DEM培養(yǎng)液中。
2. 懸浮的腫瘤細(xì)胞與1.2%藻酸鈉溶液混合，稀釋后的藻酸鈉濃度為0.8%，細(xì)胞濃度為（1~5）x106細(xì)胞/ml。
3. 把0.8%藻酸鈉的腫瘤細(xì)胞稀釋液裝入噴霧器內(nèi)，用力使液體壓出噴嘴。
4. 當(dāng)水溶性的藻酸鈉與80 mmol/l CaCl2混合，Na+被Ca2+取代后變成膠。
5. 空氣壓力和噴出的速度決定藻酸鈉膠粒的大小，可用培養(yǎng)液或0.15 mol/ NaCl漂洗膠粒。
6. 加入0.5 ml含有1%EDTA的0.9%NaCl溶液至0.5 ml 藻酸鈉包埋的細(xì)胞中。
7. EDTA能破壞Ca2+與藻酸的結(jié)合鍵，使膠轉(zhuǎn)變成液體。
8. 臺盼藍(lán)測定腫瘤細(xì)胞。
9. 用50%的藻酸鈉溶液稀釋包埋細(xì)胞，以便在恒定體積內(nèi)得到所需的腫瘤細(xì)胞數(shù)。
10. 用21號針沿腹白線皮下注射200 ul 藻酸鈉溶液包埋的腫瘤細(xì)胞，以藻酸鈉溶液作為對照。
11. 3~21天后，處死動物，從腹部皮下分離出藻酸鹽膠粒：
（1）10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，染色，進行組織化學(xué)和免疫化學(xué)檢查。
（2）諸葛將其稱重，于室溫下載水中浸泡、搖動過夜，采用Drabkin分析方法在分光光度計540 nm 測定上清液中的血紅蛋白含量。
（3）在處死動物前1 h，把51Cr標(biāo)記的紅細(xì)胞從尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)。
（4）拉頸處死小鼠后，將分離出的藻酸鈉膠粒和遠(yuǎn)離膠粒的一塊組織稱重，并用γ計數(shù)儀測定放射性。
收起
注意事項
血管生成機制復(fù)雜，參與并促進血管生成的因子也眾多，EMT腹腔液中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，其分泌的TNF-α和IL-8可以促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF)，乙酰肝素酶，血管生成素(angs)，骨生成素(OPN) ，環(huán)氧化酶(COX－2) ，缺氧誘導(dǎo)因子-1，層粘連蛋白(LN) ，胎盤生長因子(PLGF) ，Survivin，促紅細(xì)胞生成素(Epo)均參與了EMT血管形成過程。
其他
腫瘤血管生成是一個極其復(fù)雜的過程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。腫瘤血管生成的發(fā)生一方面是由于腫瘤細(xì)胞釋放血管生成因子激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，另外一方面也是因為內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌某些血管生長因子刺激腫瘤細(xì)胞的生長。腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用自始至終貫穿于腫瘤血管生成的全過程。通常，腫瘤新生毛細(xì)血管是在原有的血管基礎(chǔ)上延伸擴展而形成的，其過程類似于典型的傷口愈合和胚胎形成過程。這些新生血管為不斷浸潤生長的原發(fā)腫瘤提供營養(yǎng)，反過來，腫瘤細(xì)胞在生長過程中又分泌多種物質(zhì)以加速腫瘤新生毛細(xì)血管的形成。