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疫血清的制備實(shí)驗(yàn)
閱讀：379 發(fā)布時(shí)間：2019-2-21| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 751.6KB |
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免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑（如用于制備免疫標(biāo)記抗體等），也可供特異性免疫治療用。（來(lái)源：醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，主編金伯泉李恩善，第1 版，北京：世界圖書出版社，1990） 實(shí)驗(yàn)方法原理 具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識(shí)別，因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）。另外，抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性，現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應(yīng)答特點(diǎn)截然不同。這是由于記憶性B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。
實(shí)驗(yàn)材料 家兔
試劑、試劑盒 滅菌生理鹽水IgG酒酒羊毛脂石蠟油BCGFIAFCA-IgG
儀器、耗材 剪刀鑷子注射器針頭稱量瓶量筒動(dòng)物固定架三角燒瓶手術(shù)器械血管夾黑絲線放血管
實(shí)驗(yàn)步驟
一、免疫方法
根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說(shuō)明。
1. 用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚。
2. 次免疫
用2 ml注射器吸取弗氏*佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）下稱FCA IgG液1 ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5 ml。
3. 第二次免疫
間隔10-14 天后，于兩側(cè)窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG，每個(gè)淋巴結(jié)注0.1 ml，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1 ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時(shí)，直接注入兩側(cè)窩及鼠蹊部皮下。
4. 間隔7-10 天后，從耳靜脈采血0.5～1.0 ml，分離血清，以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)（即試血）。效價(jià)至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時(shí)才能放血。
5. 若效價(jià)未達(dá)到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1 周內(nèi)注射3 次，分別為0.1、0.3、0.5 ml。間隔1 周再試血。如效價(jià)達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外，也可在第2 次免疫后，以弗氏不*佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡(jiǎn)稱FIA-IgG）再免疫1-2 次。注射部位、劑量和間隔均同第2 次，再試血測(cè)抗體效價(jià)，如效價(jià)達(dá)到要求立即放血。
二、放血
1. 心臟采用血法
（1）家兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上（或由助手抓住四肢固定）。
（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮膚。
（3）用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)強(qiáng)的部位。
（4）用50 ml注射器（連接16號(hào)針頭），傾針45°角度，對(duì)準(zhǔn)心搏強(qiáng)處刺入心臟抽血致死。
（5）將抽取的血液立即注入無(wú)菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。
2. 頸動(dòng)脈放血法
（1）家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚。
（2）沿頸部中線切開皮膚約10 cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌。
（3）分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離。
（4）于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾住。
（5）用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。
（6）松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80～100 ml。
三、分離血清
將三角燒瓶的血置37 ℃溫箱1 小時(shí)，再置4 ℃冰箱內(nèi)3～4 小時(shí)。待血液凝固收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000 rpm離心15 分鐘，取上清加入防腐劑（0.01 ％硫柳汞或0.02 ％疊氮鈉，終濃度），分裝后置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />收起
注意事項(xiàng)
1. 免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體反應(yīng)性個(gè)體差異性較大，因此免疫時(shí)至少應(yīng)選用兩只以上動(dòng)物。另外，不能使用妊娠動(dòng)物。
2. 免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩（頻率2900 轉(zhuǎn)/分，振幅6 mm）；后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1 小時(shí)即可使抗原充分乳化。
3. 佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得價(jià)的免疫血清，但若抗原不純時(shí)，可使抗原中極微量的污染物（0.005 mgN）產(chǎn)生抗體，以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外，有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系對(duì)BCG過(guò)敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當(dāng)再次注射*佐劑時(shí)，可以引起反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時(shí)應(yīng)減少佐劑中BCG的含量或改用不*佐劑，以減少和防止反應(yīng)的發(fā)生。
4. 抗原的劑量決定于抗原的種類。對(duì)免疫原性強(qiáng)的抗原劑量應(yīng)相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對(duì)較多。抗原的用量一般以體重計(jì)算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5 mg/kg體重為宜。如不加佐劑時(shí)劑量可加大10 倍。另外，免疫周期長(zhǎng)者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。
5. 免疫方法上也可采用多點(diǎn)注射法免疫動(dòng)物。即于家兔脊柱兩旁選4-6 點(diǎn)皮下注射，同時(shí)于兩側(cè)肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一處。每點(diǎn)注0.2 ml，間隔2 周后再于上述部位選不同點(diǎn)同上注射，也可產(chǎn)生價(jià)的免疫血清。
收起
其他
一、結(jié)果鑒定
以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定所獲免疫血清的抗體效價(jià)，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量，應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線。鑒定方法的具體步驟參見(jiàn)有關(guān)部分。