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小腦顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)
閱讀：197 發(fā)布時間：2018-12-19| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 662.8KB |
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將 4~8 只新生鼠的小腦切成小立方塊，放入 HBSS，在 37°C 條件下用胰蛋白酶消化 15 min。將細(xì)胞接種于涂有 L-多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。
實驗方法原理 將 4~8 只新生鼠的小腦切成小立方塊，放入 HBSS，在 37°C 條件下用胰蛋白酶消化 15 min。將細(xì)胞接種于涂有 L-多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。
實驗材料 DMEMHBSSL-多聚賴氨酸阿糖胞苷0.025% 胰蛋白酶硅酮
儀器、耗材 P e tr i培養(yǎng)皿解剖刀解剖剪解剖鑷Pasteur吸管10ml吸管試管水浴箱
實驗步驟
1. 在無菌條件下切除小腦，放入 HBSS（含有 3 g/L BSA）。
2. 用解剖刀將腦組織切成約 0.5 mm3 大小的立方體。
3. 將組織塊移入 12 ml 試管，用 HBSS 洗 3 次。每次洗滌后讓組織塊沉到試管底部。
4. 加入 10 ml 用 HBSS 配制的 0.025 % 胰蛋白酶（用 HBSS 配制），在 37°C 條件下用水浴箱孵育 15 min。
5. 將胰蛋白酶消化的腦組織移入 50 ml 離心管，然后加入 20 ml 生長培養(yǎng)液，以終止胰蛋白酶的消化作用。
6. 通過用硅化的 Pasteur 吸管研磨使組織分散，直至獲得單細(xì)胞懸液。
硅化 Pasteur 吸管：
(a)用超純水將硅酮液稀釋為 0.1%~1%；
(b)將吸管浸人硅酮液或用硅酮液沖洗吸管內(nèi)面；
(c)放置 24 h 晾干或在 100°C 條件下放置幾分鐘使吸管變干；
(d)將吸管干熱滅菌。
用 L-多聚賴氨酸處理培養(yǎng)皿：
(a)用超純水溶解 L-多聚賴氨酸（10 mg/L）；
(b)將混合物過濾除菌；
(c)每個 35 mm Petri 培養(yǎng)皿內(nèi)加入 1 ml L-多聚賴氨酸液；
(d)10~15 min 后吸出 L-多聚賴氨酸液，加入 1~15 ml 培養(yǎng)液；
(e)將培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱內(nèi)放置 2 h 以上，至細(xì)胞接種。
7. 將盛有細(xì)胞懸液的離心管放 3~5 min，讓小的組織團塊沉到試管底。然后，用 Pasteur 吸管吸出組織團塊。
8. 將單細(xì)胞懸液離心（200 g ，5 min ) 后，吸出上清液。
9. 用生長培養(yǎng)液混懸細(xì)胞團，然后接種細(xì)胞，每個培養(yǎng)皿的細(xì)胞密度為 2.5×106~3.0×106 個。
10. 培養(yǎng) 2~4 d 后（兩天后），加入 5~10 μmol/L 阿糖胞苷，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。
11. 用 DMEM （含有 30 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、24.5 mmol/L 、100 mU/L 胰島素（Sigma，Ⅰ-1882）、7 μmol/L 對氨基苯甲酸（Sigma，A -3659）、100 μg/ml 慶大霉素和 10 % 加熱滅活的 FCS）換液。