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成纖維細(xì)胞的分離

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下述的通用操作方案適用于小鼠、大鼠、倉鼠和雞胚胎。選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎,10~13 天齡胚胎含有大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞,成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。本實(shí)驗(yàn)來源于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南(上冊(cè)),作者:黃培堂。實(shí)驗(yàn)方法原理    下述的通用操作方案適用于小鼠、大鼠、倉鼠和雞胚胎。選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎,10~13天齡胚胎含有大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞,成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。圖4.1顯示了小鼠胚胎的取出和解剖,圖4.2顯示的是雞胚胎的取出過程。




實(shí)驗(yàn)步驟    
1) 胚胎的分離。

適用哺乳動(dòng)物(倉鼠、小鼠和大鼠)

a. 采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物。

b. 立即在無菌超凈臺(tái)內(nèi)用 70% 乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。若可能,置紫外燈下照射 5 分鐘。

c. 用無菌的鑷了和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。

d. 用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部,取出含有胚胎的子宮,置于無菌的培蕎皿上。

e. 剔除胚胎周圍的包膜,將胚胎放于無菌的含有無菌 PBS 的燒瓶中。

f. 漂洗胚胎,去掉 PBS。繼續(xù)用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

適用雞胚胎

a. 用 70% 乙醇擦洗雞蛋殼。

b. 用無菌剪刀輕敲雞蛋的圓端,輕輕去除蛋殼露出氣囊。

c. 用無菌攝子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜。

d. 剪開包膜,用彎鑷夾住胚胎頸部取出胚胎。

e. 棄頭部,將無頭的胚胎置于廣口燒杯中,用 PBS 漂洗。

2) 將 6~8 個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的無菌廣口燒杯屮,用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎,

用 PBS 漂洗。

3) 在無菌狀態(tài)下,將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一 500 ml 的無菌的有攪拌棒的燒杯中,加人

200~300 ml 用 HBSS 配制的 0.25% 的無菌胰蛋白酶(CIBCO/BRL)。

4) 在溫暖的環(huán)境中或置于 37°C 培養(yǎng)箱中輕輕攪動(dòng) 15 分鐘。

5) 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降,將含冇懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無菌大容積的離心管中,該管內(nèi)按照每 10 ml 上清加人 1 ml 牛血清的比例加人牛血淸以滅活胰蛋白酶。

6) 加人新鮮胰蛋白酶溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的 500 ml 燒杯中,重復(fù)步驟 4 和 5。

7) 離心混合的細(xì)胞懸液,1200r/min,5 分鐘,棄上清。

8) 用新鮮的無菌 PBS 重懸沉淀的細(xì)胞,按步驟 7 再次離心。

9) 用 PBS 反復(fù)洗滌細(xì)胞至上清清亮為止。

即用含有 10% 牛血清和抗生素(如青霉素、鏈霉素)的 DMEM(CIBCO/BRL)10 ml 再懸沉淀,并使終體積為 100 ml。

11) 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降。

可采用數(shù)層無菌紗布過濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞塊。

12) 為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度,加人 0.2 ml 細(xì)胞懸液于 1.8 ml1% 醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(見第 2 節(jié)中的"細(xì)胞計(jì)數(shù)")

13) 按每 10 mm 平皿 1x107 至 4x107 細(xì)胞的數(shù)量接種于 10 ml 組織培養(yǎng)液中,在飽和濕度的 C02 培養(yǎng)箱中孵育直至細(xì)胞鋪滿。

14) 當(dāng)細(xì)胞長滿后,去除培養(yǎng)液,用 10% 的溫暖的 Versene(用 PBS 配制的 0.53 mmol/L EDTA,GIBCO/BRL) 洗滌細(xì)胞層 2 次。

15) 棄 Versene,加人相同體積的溫暖化 0.05% 胰蛋白酶-EDTA(GIBCO/BRL)

16)37°C 孵育 5 分鐘

17) 用無菌吸管輕輕吹散細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移至一含 1~2 ml 牛血清的無菌管中。

18) 離心,1200/min,5 分鐘,棄上清。

19) 再懸沉淀于 5 ml 培養(yǎng)液屮(見上文),另加人 15 ml 培養(yǎng)液,分裝于 2 個(gè) 100 mm 平皿中。

20) 置 37°C 飽和濕度的 C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞,直至細(xì)胞長滿,繼續(xù)步驟 14~20 以傳代細(xì)胞。

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