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1。介紹

細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化特征為凋亡，同時(shí)伴有*的生化事件：核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的核DNA斷裂。事實(shí)上，形成寡核糖體大?。?80-200bp）的DNA段是許多細(xì)胞類型中細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。
本協(xié)議提供了一種DNA段化和完整DNA段的分離方法，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。在凋亡細(xì)胞中，由于多個(gè)DNA段，特異性DNA裂解在電泳分析中作為典型的梯形圖案變得明顯。然而，雖然這個(gè)方案簡(jiǎn)單，通常能夠提供良好的結(jié)果，它只是定性的，因?yàn)樗贒NA回收和增溶方面的局限性。為了獲得較清潔的DNA，需要其他的DNA制備方法（在某些情況下，推薦使用蛋白酶K進(jìn)行脫蛋白）。

2。協(xié)議

2.1。材料
在*RPMI培養(yǎng)基（A1）中1-5x106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液
TTE溶液：TE緩沖液pH 7.4（A1），0.2% Triton X-100（存儲(chǔ)在4°C）
NaCl 5m，冰冷
Isopropanol，冰冷
70%乙醇，冰冷
Te緩沖液pH 7.4（A1）
加載緩沖器10x（A1）
電泳緩沖液（A1）
溴化乙錠溶液（A1）
電泳級(jí)瓊脂糖
DNA分子量標(biāo)記
冷凍細(xì)胞離心機(jī)（A3）
Microfuge（A3）
加熱塊（A3）
凝膠電泳儀（A3）
直流電源（A3）
紫外線透射器（A3）
寶麗來(lái)相機(jī)+膠片（A3）

2.2。方法

1。分配0.5毫升細(xì)胞懸浮液（不少于5x105），否則DNA不能通過(guò)照相溴化乙錠染色凝膠檢測(cè)，且不超過(guò)5x106，以避免在B（底）標(biāo)記的管中難以處理過(guò)多的不溶性DNA。
2。在4℃下，在200℃下離心10分鐘。

三。在上標(biāo)的S（上清液）中仔細(xì)轉(zhuǎn)移上清液。

4。在管內(nèi)加入球團(tuán)B 0.5毫升的TTE溶液并大力旋渦。該程序允許在細(xì)胞裂解(由于在TTE溶液中存在Triton X-100)和核結(jié)構(gòu)破壞(在TTE溶液中通過(guò)EDTA的Mg++螯合之后)之后從細(xì)胞核釋放碎片染色質(zhì)。

5。為了從完整的染色質(zhì)中分離片段DNA，用20000xg離心管B，在4℃下離心10分鐘。

6。在T（Top）標(biāo)記的新管中小心地轉(zhuǎn)移上清液。

7。加入小顆粒在管B 0.5毫升TTE溶液中。

8。在管B、S和T中加入0.5ml體積、0.1ml冰冷的5M氯化鈉和渦流。鹽的加入應(yīng)該能夠從DNA中去除組蛋白。

9。每管加入0.7毫升冰冷異丙醇和大力旋流。

10。允許沉淀在-20℃下過(guò)夜進(jìn)行。這一步驟可以通過(guò)將樣品放入乙醇/干冰浴中1小時(shí)來(lái)縮短。

11。沉淀后，在4℃下，在200萬(wàn)Xg下用球?；厥誅NA 10分鐘。

12。通過(guò)抽吸或快速倒置管丟棄上清液，用紙巾角小心地移除任何殘留在管壁上的液滴或液體。這可能是一個(gè)關(guān)鍵的步驟，因?yàn)轭w粒可能松散和透明，難以看到。

13。將每小管加入0.5-0.7ml冰冷70%乙醇，漂洗小球。

14。在4℃下，在200萬(wàn)Xg下離心管10分鐘。

15。通過(guò)抽吸或快速倒置管丟棄上清液。用吸濕紙巾將管子倒置30分鐘，仔細(xì)地清除任何殘留在管壁上的液滴或液體。在繼續(xù)操作之前，讓空氣在直立位置干燥管至少3小時(shí)。

16。加入20-50m l的TE溶液，溶解DNA，置于37℃下1-3天。DNA的重新溶解可能是一個(gè)關(guān)鍵的步驟，事實(shí)上，它取決于樣品中存在的DNA數(shù)量和大小。因此，B管中所含的非段DNA可能需要更高體積的TE和更長(zhǎng)的孵育時(shí)間以便重新懸浮。

17。將DNA樣品與加載緩沖液混合，加入10倍的負(fù)載緩沖液，使其達(dá)到1X的終濃度，加入緩沖液使樣品更容易加載凝膠威爾斯，并監(jiān)測(cè)樣品的運(yùn)行。

18。將樣品放置在65℃的加熱塊中10分鐘，立即將其10-20mL加載到含有溴化乙錠0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)1%瓊脂糖凝膠的每個(gè)孔中，應(yīng)包括適當(dāng)?shù)腄NA分子量標(biāo)記。溴化乙錠是一種潛在的致癌物質(zhì)：戴手套和小心輕放。

19。在將電壓設(shè)置為所需電平后，在標(biāo)準(zhǔn)TBE緩沖區(qū)中運(yùn)行電泳。在電泳過(guò)程中，可以通過(guò)跟蹤載入緩沖液中的溴酚藍(lán)染料的遷移來(lái)監(jiān)測(cè)樣品的遷移。

20。當(dāng)染料從凝膠末端到達(dá)約3厘米時(shí)停止電泳。

21。為了可視化DNA，將凝膠放置在紫外線透射儀上。

紫外線透射儀并拍攝凝膠照片。紫外線照射時(shí)佩戴眼部和皮膚保護(hù)。

三。評(píng)論

3.1。背景信息
細(xì)胞凋亡是真核細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制，在許多生理和病理過(guò)程中起著重要作用。因此，從理論和應(yīng)用的角度，明確細(xì)胞凋亡的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制和生化過(guò)程是一個(gè)重要的挑戰(zhàn)。

在凋亡過(guò)程中，細(xì)胞發(fā)生一系列重組：染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞體積減少和膜起泡是凋亡細(xì)胞明顯的形態(tài)學(xué)改變。雖然導(dǎo)致這種變化的分子機(jī)制還不*清楚，但其中許多似乎與生化事件并行進(jìn)行。例如，這就是染色質(zhì)凝聚和核膜破裂的情況。事實(shí)上，與之并行的是DNA斷裂，這是大多數(shù)細(xì)胞凋亡的一個(gè)生化標(biāo)志。DNA裂解被認(rèn)為是一種內(nèi)源性Ca++-和Mg++依賴性內(nèi)切酶，能夠在核小體間位點(diǎn)斷裂雙鏈DNA。因此，凋亡的DNA切割導(dǎo)致寡核糖體大?。?80-200bp）的特征性片段。這種現(xiàn)象，次由WyLee（1980）描述，可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析來(lái)可視化。本方案提供了一種定性測(cè)定DNA 段的方法。

3.2。臨界參數(shù)

DNA電泳分析關(guān)鍵的一點(diǎn)是它不能定量測(cè)定細(xì)胞凋亡。事實(shí)上，由于與大DNA的不溶性有關(guān)的問(wèn)題，因此其終的瓊脂糖凝膠分析，該方法是嚴(yán)格定性的。
此外，當(dāng)描述凋亡刺激后DNA段化的不同行為時(shí)，不推薦這種方法。事實(shí)上，在一些隨機(jī)雙鏈或罕見(jiàn)單鏈DNA斷裂發(fā)生的細(xì)胞類型中，它不能被瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

有時(shí)，特別是從離體培養(yǎng)物(例如胸腺細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)獲得的細(xì)胞，可以觀察到自發(fā)DNA斷裂的高背景。

3.3。故障排除

在試管B中收集的染色體長(zhǎng)度DNA的溶解通常是困難的。沉淀后DNA的重新溶解可能需要增加TE體積和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。使用有限數(shù)量的單元（小于5x106）將有助于限制這個(gè)問(wèn)題。然而，由于該方法僅是定性的，所以分析存在于T管中的片段DNA是該分析的主要興趣。

3.4。預(yù)期結(jié)果

DNA瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)為細(xì)胞凋亡的定義提供了良好的結(jié)果。在大多數(shù)凋亡細(xì)胞中，應(yīng)觀察到典型的梯形DNA斷裂模式。
3.5。時(shí)間考慮
用于瓊脂糖凝膠電泳分析的DNA的制備取決于樣品的DNA大小：一般需要2至7天。進(jìn)行電泳需要額外4-8小時(shí)。
3.6。關(guān)鍵參考文獻(xiàn)
1。Wayle，A.H. 1980。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞凋亡與內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活性有關(guān)。自然284：555。
2。杜克，R.C.，科恩，J.J 1986。內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)的DNA斷裂：細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的早期事件。PROCNATL阿卡德SCI。美國(guó)80：6361。

三。阿倫德斯，M.J.，Morris，R.J.，威利，A.H 1990。細(xì)胞凋亡核酸內(nèi)切酶的作用。是。J. Pathol。136：593。

4。Bortner，C.D，奧爾登堡，N.B.E，Cidlowski，J.A. 1995。DNA段化在細(xì)胞凋亡中的作用趨勢(shì)細(xì)胞生物5:21。

5。Sellins，K.S.，科恩，J.J 1991。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在不同來(lái)源的靶細(xì)胞中誘導(dǎo)不同類型的DNA損傷。J. Immunol。147：795。

附錄1（A1）：庫(kù)存解決方案

解決方案

制備

保管部
完成
RPMI培養(yǎng)基

RPMI-1640培養(yǎng)基中添加5%熱滅活胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES緩沖液、50g/ml硫酸慶大霉素。L-谷氨酰胺是不穩(wěn)定的，因此不超過(guò)4°C持續(xù)一天以上。
4°C
Te緩沖液10 mM TrI.Cl pH 7.4（通過(guò)稀釋原料溶液制備），1毫米EDTA。
RT
Tris.Cl原液(1M)將121g Tris堿溶于800毫升H2O中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)到需要的pH，混合并加入H2O至1升。
注意：在使用Tris緩沖液的相同溫度下調(diào)節(jié)其pH，因?yàn)閜H隨溫度變化（每1°C約0.028個(gè)pH單位）。

RT
加載緩沖器10X

在指示的終濃度下加入下列試劑制備裝載緩沖液的濃縮原液：20%Ficoll 400、0.1M EDTA(pH 8.0)、1%SDS、0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯氰醇(任選)。
RT
緩沖庫(kù)存解決方案

溶于800毫升H2O 108克三堿基（89毫米），55硼酸（89）