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多重 PCR反應(yīng)循環(huán)條件的優(yōu)化

延伸溫度（步驟 5 ， A-C ） . Figure 2c 展示了當(dāng)加入相等量 (0.4 μM each) 的四種用于擴(kuò)增 Y 染色體上不同基因的引物進(jìn)行多重 PCR 時(shí)，用程序 A 和程序 B 擴(kuò)增得到的結(jié)果 (Table 2) ，程序 B 有更高的延伸溫度 (72 ℃ ) 和更長(zhǎng)的退火和延伸時(shí)間?？偟膩?lái)說(shuō)，用程序 A 對(duì) Y-1, Y-3* 和 Y-4 的擴(kuò)增得到了更高產(chǎn)量的 PCR 產(chǎn)物。此外，用程序 B 擴(kuò)增時(shí)某些產(chǎn)物消失 (Y-1 、 Y-2) ，同時(shí)出現(xiàn)了某些非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物 (Y-1 、 Y-3*) 。程序 B 得到的結(jié)果更差一些，表明高的延伸溫度減少了某些基因的擴(kuò)增，盡管我們?cè)噲D用長(zhǎng)的退火時(shí)間和延伸時(shí)間來(lái)消除這種影響。

延伸時(shí)間（步驟 5 ， A, B 和 D ） . 在多重 PCR 中，由于同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因，酶和 dNTP 的缺乏就成為限制因素，就需要更多的時(shí)間來(lái)完成所有產(chǎn)物的合成。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)表明了延伸時(shí)間的影響。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一對(duì) Y 染色體引物 (Y6BaH34pr, 910bp) 被加入 X 染色體引物混合物 (X-3) 中。結(jié)果表明 (Figure 3b) ，多重 PCR 中增加延伸時(shí)間 ( 程序 A 與程序 D) 可以增加較長(zhǎng)的 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用程序 C 和 A （ Figure 3a 和 Table 2 ）擴(kuò)增四個(gè) Y 染色體上的基因。當(dāng)延長(zhǎng)延伸時(shí)間時(shí)，所有基因的 PCR 產(chǎn)物量都增加了。

退火時(shí)間和退火溫度 （步驟 5 ， A-D; Figure 1 ） . 將退火時(shí)間從 20 秒改為兩分鐘并未改變擴(kuò)增效率，但退火溫度卻是重要的參數(shù)之一。盡管許多基因能在退火溫度為 56 ℃ –60 ℃被特異的擴(kuò)增，我們的經(jīng)驗(yàn)表明 將退火溫度降低 4 ℃ –6 ℃對(duì)于在多重 PCR 中擴(kuò)增出同樣的基因是必需的。 Figure 3, d–f 展示了這種情況，單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)退火溫度為 60 ℃的基因在多重 PCR 中退火溫度為 54 ℃時(shí)優(yōu)。盡管在 54 ℃時(shí)可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增（如 Figure 3c ），但多重反應(yīng)中并發(fā)的其他基因的特異擴(kuò)增會(huì)消除非特異性擴(kuò)增的影響。相似的，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增許多特異的基因時(shí)，擴(kuò)增效率高的基因會(huì)使擴(kuò)增效率低的基因的擴(kuò)增產(chǎn)量降低。這是由于在 PCR 反應(yīng)中酶和 d NTP 的供應(yīng)是有限的，所有的產(chǎn)物都是由同樣的一組原料生成。

PCR 循環(huán)數(shù) . 引物混合物 Y-3* 被用于擴(kuò)增兩個(gè)不同的基因組 DNA 樣品，以不同的循環(huán)次數(shù)做多次實(shí)驗(yàn) (Figure 4a) 。其中的一個(gè)基因組模板質(zhì)量更高或 DNA 含量更高?？梢钥闯?，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加時(shí)，兩組樣品的各擴(kuò)增帶的產(chǎn)量都逐漸增加。 PCR 產(chǎn)物量增加明顯是在 25 個(gè)循環(huán)附近。通常對(duì)于一個(gè)反應(yīng)， 28 至 30 個(gè)循環(huán)足矣，增加至 60 個(gè)循環(huán)對(duì)產(chǎn)物量無(wú)明顯影響。

多重反應(yīng)中試劑組分的優(yōu)化

當(dāng)使用同樣的擴(kuò)增程序時(shí)，不同的實(shí)驗(yàn)間存在差異 (Figures 2c 和 3a) 。解決重復(fù)性問(wèn)題要求調(diào)節(jié) PCR 反應(yīng)組分。

引物的量 ( 步驟 5, B 和 C). 初，在多重 PCR 反應(yīng)中使用了相等物質(zhì)量的引物（每種引物為 0.2–0.4 μ M ） (Figure 3c) 。但是擴(kuò)增并非均一的，即使在優(yōu)化了循環(huán)條件后，某些基因的擴(kuò)增產(chǎn)物仍不明顯。解決這一問(wèn)題，要求改變反應(yīng)中各種引物的比例，要增加"弱"基因的引物量，而要減少"強(qiáng)"基因的引物量。不同基因相對(duì)的引物終濃度有明顯的差異 (0.04–0.6 μ M) ，這*取決于經(jīng)驗(yàn)。

dNTP和MgCl 2 的濃度（步驟 5D）.

dNTP. 用引物混合物 Y-4 檢測(cè)了多重 PCR 反應(yīng)中 dNTP 濃度的影響。氯化鎂濃度保持恒定 (3 mM) ，而 dNTP 的濃度從每種 50 μ M 逐漸增加到每種 1200 μ M(Figure 4b) 。當(dāng) dNTP 濃度為每種 200 μ M 和每種 400 μ M 時(shí)結(jié)果好，濃度繼續(xù)增加時(shí)擴(kuò)增被迅速抑制。降低 dNTP 濃度 (50 μ M) 不抑制擴(kuò)增，但擴(kuò)增產(chǎn)物的量會(huì)減少。 dNTP 母液對(duì)于反復(fù)凍融十分敏感，反復(fù)凍融 3–5 次后，多重 PCR 反應(yīng)常常不能很好進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物幾乎*不可見(jiàn)。為了避免這一問(wèn)題，應(yīng)分裝出小份的 dNTP(25 mM each, 2–4 μ L, 10–20 次反應(yīng) ) ，凍存于 -20 ℃，使用前離心。 dNTP 的這種低穩(wěn)定性在單一基因擴(kuò)增中并不明顯。

MgCl 2 . 在 dNTP 濃度為每種約 200 μ M 的標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)中 MgCl 2 的濃度建議為 1.5 mM 。為測(cè)試 MgCl 2 的影響，將 dNTP 濃度保持在 200 μ M 進(jìn)行多重 PCR 反應(yīng) (mixture Y-3) ， MgCl 2 濃度從 1.8mM 逐漸增加到 10.8 mM (Figure 4c) 。隨著 MgCl 2 濃度的逐漸升高，擴(kuò)增反應(yīng)的特異性逐漸增強(qiáng)（非特異性條帶消失），產(chǎn)物量逐漸增多 (10.8 mM) 。在 MgCl 2 濃度為 20 mM 的 PCR 反應(yīng)中，產(chǎn)物幾乎不可見(jiàn)，似乎反應(yīng)被抑制了。

dNTP/MgCl 2 的平衡 . Taq DNA 聚合酶正確工作時(shí)需要游離的鎂離子 (9) （不包括與 dNTP 和 DNA 結(jié)合的鎂離子）。這也許是 dNTP 濃度增加時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)被迅速抑制 (Figure 4b) 而增加鎂離子濃度能消除這種抑制現(xiàn)象 (Figure 4c) 的原因。通過(guò)對(duì)各種 濃度 dNTP 和 MgCl 2 的組合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，濃度為每種 200 μ M 的 dNTP 要得到好的擴(kuò)增結(jié)果需要 1.5–2 mM MgCl 2 ，而濃度為每種 800 μ M 的 dNTP 要得到好的擴(kuò)增結(jié)果至少需要 6–7mM 的 MgCl 2 。濃度為每種 200 μ M 的 dNTP 擴(kuò)增反應(yīng)要求的 閾 值為 1 mM MgCl 2 ，當(dāng) MgCl 2 低于這一閾值時(shí)，擴(kuò)增會(huì)減少。

PCR 緩沖液（ Kcl ）的濃度 . PCR 緩沖液的比較 (Step 5, B–D).

KCl 或 PCR 緩沖液濃度 . 提高 PCR 緩沖液的濃度為 2x （或僅將 KCl 的濃度增加到 100mM ）可以提高多重 PCR 的效率 (Figure 4d 及 Figure 3, d–f) ，這種調(diào)節(jié)作用比調(diào)節(jié) DMSO ，甘油或 BSA 更重要。通常產(chǎn)生長(zhǎng)片斷擴(kuò)增產(chǎn)物的引物在低鹽濃度下擴(kuò)增結(jié)果更好，而產(chǎn)生短片斷擴(kuò)增產(chǎn)物的引物在高鹽濃度下擴(kuò)增結(jié)果更好，高鹽濃度會(huì)使長(zhǎng)片斷擴(kuò)增產(chǎn)物難于變性解鏈 ( 比較 Figure 4d 中 0.4x 緩沖液與 2.8x 緩沖液 ) 。例如， sY94 引物對(duì) ( 熔點(diǎn)為 58 ℃ ) 在緩沖液的濃度為 0.8x 時(shí)擴(kuò)增效果優(yōu)于 sY88 引物對(duì) ( 熔點(diǎn)為 58 ℃ ) 和 sY151 引物對(duì) ( 熔點(diǎn)為 52 ℃ ) ，但在高的鹽濃度條件下， sY94 引物對(duì)的擴(kuò)增效果無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。合適的緩沖液濃度可以克服產(chǎn)物大小和 GC 含量等因素的影響。

PCR 緩沖液的比較 . 我們還比較了原先提到的被稱為 DMD 的多重 PCR 緩沖液 (6) 和相對(duì)簡(jiǎn)單的 KCl 緩沖液在多重 PCR 反應(yīng)中的差異。 5x 的 DMD 緩沖液含有 83 mM(NH 4 ) 2 SO 4 , 335 mM Tris-HCl (pH8.8), 33.5 mM MgCl 2 , 50 mM β -mercaptoethanol （β－巰基乙醇）和 850 μ g/mL BSA ，緩沖液 DMD 的使用終濃度為 1x ，與 10% DMSO 和 1.5 mM each dNTP 同時(shí)使用 (1,2,4) 。實(shí)驗(yàn)表明用 1.6x 的常規(guī) KCl 緩沖液比用 DMD 緩沖液擴(kuò)增 DMD 基因 ( 引物混合物 X-1) 效果更好，明顯見(jiàn)到更多的 PCR 產(chǎn)物 (Figure 4e) 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用病人的 DNA 樣品做了十二次重復(fù)，重復(fù)性很好。 KCl 緩沖液相對(duì)簡(jiǎn)單，便于調(diào)節(jié)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。低 dNTP 濃度時(shí) Taq DNA 聚合酶的保真性更高 (9) 。使用 KCl 緩沖液（要求更少的 dNTP ）有利于對(duì) PCR 產(chǎn)物做進(jìn)一步的突變分析。

模板 DNA 的量和 Taq DNA 聚合酶 ( 步驟 5, A 和 D). 當(dāng)每 25 μ L 反應(yīng)體積中 DNA 的模板量為 30ng 到 500ng 時(shí)，混合物 Y-3* 未表現(xiàn)出明顯差異 (Figure 4f) ，然而當(dāng)模板量低于 30ng 時(shí)，某些 PCR 產(chǎn)物的量會(huì)減少。當(dāng)模板量很低時(shí)（ pg 級(jí)的 DNA ），擴(kuò)增的效率與特異性可以通過(guò)進(jìn)一步降低退火溫度來(lái)優(yōu)化，有時(shí)甚至要降低 10 ℃ –12 ℃（數(shù)據(jù)未顯示）。使用引物混合物 Y-3(Figure ) 來(lái)測(cè)試不同 Taq DNA 聚合酶的濃度 (Perkin-Elmer) 。 Taq DNA 聚合酶的適濃度為每 25 μ L 反應(yīng)體積中 0.4 μ L 或 2U 。也許是由于 Taq DNA 聚合酶中甘油濃度過(guò)高，加入過(guò)多的 Taq DNA 聚合酶會(huì)導(dǎo)致不同基因擴(kuò)增不平衡及背景的輕微增高。在 1.6xPCR 緩沖液中使用自制的五種不同來(lái)源的 Taq DNA 聚合酶（每 25 μ L 反應(yīng)體積中加入 2U ）對(duì) Y-4 引物混合物的反應(yīng)體系擴(kuò)增得到了相似的結(jié)果 (Figure 5b) 。

佐劑的使用： DMSO, 甘油 , BSA (Step 5E). 許多作者建議使用濃度范圍為 5%–10% (v/v) 的 DMSO 和甘油來(lái)改善擴(kuò)增的效率（提高產(chǎn)物量）和特異性（沒(méi)有非特異性產(chǎn)物） (9) 。然而在多重反應(yīng)中， DMSO 的使用會(huì)給出矛盾的結(jié)果。例如， 5% DMSO 增加了某些基因的產(chǎn)物量，減少了另一些基因的產(chǎn)物量，而對(duì)某些基因卻沒(méi)有任何影響 (Figure 5c) 。使用 5% 的甘油也得到了相似的結(jié)果。因此， DMSO 和甘油的調(diào)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索。加入濃度達(dá) 0.8 μ g/ μ L BSA （比以前描述得更高）比加入 DMSO 和甘油更能提高 PCR 擴(kuò)增的效率。 BSA 對(duì)任何基因的擴(kuò)增都未產(chǎn)生抑制作用。