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PCR技術(shù)之PCR污染與對策
閱讀：229 發(fā)布時間：2018-8-28PCR反應的大特點是具有較大擴增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污 染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生.
一、污染原因
(一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于 密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提 取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠 或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染.
(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染.
(三)PCR擴增產(chǎn)物污染.這是PCR反應中主要常見的污染問題.因為PCR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性.
還有一種容易忽視，可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩 擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣 槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.
(四)實驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的 檢驗室，這個問題也比較常見.因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化 過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡 便性及具有很強的生命力.其污染可能性也很大.
二、污染的監(jiān)測
一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.
對照試驗
1.陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR 反應是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志.陽性 對照要選擇擴增度中等、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽 性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下).但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽 性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設陽性對照.
2.陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照.它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用 鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照.②試劑 對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染.
3.重復性試驗
4.選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增
三、防止污染的方法
(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定 等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應與其它步驟嚴格分開. 能劃分①標本處理區(qū);②PCR反應液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū). 其實驗用品及吸樣槍應.實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA.
(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題.由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸 樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染.
(三)預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先 配制好，然后小量分裝，-20℃保存.以減少重復加樣次數(shù)，避免污染機會.另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應放于同一冰盒或同一 冰箱.
(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用.
(五)設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的低量的標準病 原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照 及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照.
(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止.
(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前 應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出.