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1．  材料和試劑

1.1培養(yǎng)液A ：DMEM培養(yǎng)液添加10%的胎牛血清（FBS）。

1.2培養(yǎng)液B：DMEM培養(yǎng)液添加10%的胎牛血清（FBS）和終濃度為0.7--1μg/ml

的放線菌素D。

1.3  L929細(xì)胞株：鼠結(jié)締組織纖維母細(xì)胞，來(lái)源于22天雄性C3H鼠皮下組織。

1.4  結(jié)晶紫染色溶液：0。05%結(jié)晶紫 (50mg結(jié)晶紫加入20ml乙醇,加蒸餾水定容至100ml)，蒸餾水稀釋。

1.5 脫色液：（1）乙二醇獨(dú)甲醚50%，蒸餾水稀釋。

（2）乙醇50%，乙酸0.01%(V/V)，蒸餾水稀釋。

1.6 胰酶：消化貼壁L929細(xì)胞。

1.7 半效稀釋度TNF標(biāo)準(zhǔn)品：1000IU/ml。

2. 實(shí)驗(yàn)用具

超凈工作臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)烘箱，酒精燈，顯微鏡，細(xì)胞計(jì)數(shù)器，微量移液器，細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞稀釋槽，酶標(biāo)儀。

3. 操作步驟

3．1樣板：棄L929細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入800—900μl胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞收縮后，棄胰酶，加入4ml培養(yǎng)液A，吹打細(xì)胞，混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并計(jì)算所需細(xì)胞總數(shù)，培養(yǎng)液體積，將消化好未貼壁的細(xì)胞重新懸浮于*培養(yǎng)液A，并調(diào)整細(xì)胞濃度為10×104/ml左右并將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl,37°C，5%CO2

培養(yǎng)過(guò)夜或24小時(shí)，待細(xì)胞貼滿板壁80%以上時(shí)，方可加樣。

3．2 樣品處理和稀釋：將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用培養(yǎng)液B溶解至1 ml，（樣品為凍干粉狀）。如標(biāo)準(zhǔn)品為1000IU/ml，10倍稀釋至100IU/ml作為起始濃度，樣品則根據(jù)實(shí)際情況都做10倍梯度稀釋，并以低濃度定為起始濃度（以上操作均在24孔板中操作）。

從樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中的起始濃度中取200μl加入到96孔板A2-A12中，其余各孔均加入150μl培養(yǎng)液B，再?gòu)腁2-A12中各取50μl，對(duì)B-H各排進(jìn)行逐級(jí)四倍梯度稀釋.

3．3 加樣：標(biāo)準(zhǔn)品和樣品經(jīng)稀釋后，吸去已經(jīng)培養(yǎng)好的細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔依次加樣100μl，并在邊緣未加樣的各孔加入100μl培養(yǎng)液B，消除邊緣效應(yīng)，放入烘箱37°C，5%CO2，培養(yǎng)過(guò)夜。

3．4 染色和脫色：L929細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，鏡檢在半數(shù)死亡孔到達(dá)D或E時(shí)終止反應(yīng)，吸取上清，輕輕吹打2—3次，除死細(xì)胞，每孔加入染色液30μl，靜置5分鐘左右。

用流水輕輕沖掉染色液，每孔加入100μl脫色液脫色，輕輕搖動(dòng)使脫色*，然后于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)O.D.值,并設(shè)對(duì)照.

4. 處理數(shù)據(jù):在座標(biāo)紙上以570nm O.D.值(雙孔加樣測(cè)兩點(diǎn)值的平均)對(duì)稀釋倍數(shù)做圖,并以標(biāo)準(zhǔn)品的低,高O.D.之平均值做一平行于X軸的直線交各曲線,以各相應(yīng)曲線與該直線交點(diǎn)在X軸上讀出半效量的稀釋度,按下式計(jì)算效價(jià):

TNF成品活性(IU/ml)=標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)*(樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù))*(標(biāo)準(zhǔn)品半效量稀釋度/樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋度)