線粒體是細胞的動力源，因為它們以三磷酸腺苷（ATP）的形式產生了大部分的能量供應。線粒體是一種雙膜細胞器：一種外膜和一種折疊的內膜，稱為嵴。分離的線粒體是研究線粒體呼吸、呼吸復合體組裝、細胞凋亡、mtDNA和mtRNA以及線粒體蛋白分析的首-選樣本。

Biogradetech線粒體提取試劑盒為分離完整的線粒體提供了兩種選擇。第一種選擇是利用一種基于試劑的方法，允許平行處理多個樣品。第二種選擇使用傳統(tǒng)的跳躍均質化，這提供了更好的線粒體產量。

微光應用程序：

從組織和培養(yǎng)細胞中分離出高純度、完整和有功能的線粒體。

線粒體呼吸研究，復合物的組裝，細胞凋亡，mtDNA和mtRNA，以及蛋白質譜分析。

西方印跡和ELISA。

線粒體提取樣品類型：

哺乳動物組織。

培養(yǎng)細胞。

儲存和處理：

存儲工具包在-20°C，避光。在使用前解凍試劑。在進行實驗前，請讀取整個方案。

艾美捷 線粒體提取試劑盒 （D-AKE4003-50T）分離方案：

1.樣品制備：

a. 培養(yǎng)細胞：小顆粒2 x107細胞在600 xg下離心10 min。小心地去除并丟棄上清液。

b. 組織：分離出感興趣的組織。將組織（50-200 mg）浸泡在1毫升冰冷的線粒體分離緩沖液中，并沖洗兩次以除去血液。用1毫升冰冷的線粒體分離緩沖液，用剪刀將放在冰上的組織切成小塊。將切碎的組織在桌面離心機中以10000xg旋轉2 min。棄用緩沖液，換上1 ml新鮮冰冷的線粒體分離緩沖液。

2.線粒體分離的程序：

a.使用Dounce均質器分離線粒體：在線粒體分離緩沖液中使用預冷玻璃均質器對組織或細胞進行均質化。在冰上敲擊樣品3-4次。組織或細胞與線粒體分離緩沖液之間的最佳比例范圍為1：5-1：10（w/v）。將勻漿轉移到試管中，以600 x g離心10 min。在4°C。將上清液收集于單管中，7000xg離心10 min。在4°C。棄出上清液，再次用線粒體分離緩沖液清洗顆粒。取出上清液，在存儲緩沖液中重懸線粒體。確定蛋白質濃度，并使用存儲緩沖液調整到所需的蛋白質濃度。

b.基于試劑分離線粒體方法：在細胞顆粒中加入1 ml線粒體分離緩沖液，渦旋5秒，冰孵育2 min。加入10µl試劑A，渦旋5秒。冰敷5 min。同時每分鐘旋轉一次。持續(xù)5秒。600 x g離心機，離心機為10 min。在4°C。將上清液收集于單管中，7000xg離心10 min。在4°C。棄出上清液，用線粒體分離緩沖液清洗顆粒。取出上清液，在存儲緩沖液中重懸線粒體。確定蛋白質濃度，并使用存儲緩沖液調整到所需的蛋白質濃度。

記下

a.為了避免蛋白質降解，建議您在線粒體分離緩沖液中加入蛋白酶抑制劑雞尾酒。

b.均質化的中風次數(shù)將取決于細胞或組織類型的不同。

c.對于細胞，為了檢查細胞裂解效率，將5µl的細胞裂解液涂成載玻片，加入蓋層，在顯微鏡下觀察。對于組織，進行足夠的中風以獲得均勻的懸浮液而不溶解細胞。通常對于軟組織，10,15次中風和對于硬組織，5-10次中風就足夠了。

3.基于應用程序的存儲條件：對于完整的線粒體，在存儲緩沖液中重懸。保持冰立即使用或在液氮中快速冷凍，儲存在-80°C以備將來使用。為了裝載凝膠的目的，線粒體可以存儲在適當?shù)臉悠?span style="font-family: Calibri;">PAGE緩沖液中（未提供）。

圖：線粒體完整性檢測：按照上述方案，從小鼠肝臟中純化出線粒體（100µg）。用JC-1染料檢測純化后的線粒體的完整性，該染料檢測線粒體內膜的電化學化質子梯度（ΔΨ）。將純化后的線粒體放在冰上解凍，并與JC-1染料（1µg/ml）孵育15 min。在37°C。完整的純化線粒體顯示JC-1染料的聚集，其信號可以在Ex/Em = 530/590 nm處測量。用抗-霉-素A（100µM）處理可消散線粒體膜電位，導致熒光信號降低。

*僅供研究使用！不能用在人類身上