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在選擇PCR儀時要注意哪些參數(shù)呢
閱讀：1800 發(fā)布時間：2018-11-10
在選擇PCR儀時要注意哪些參數(shù)呢？
1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上發(fā)表文章準確、精煉、客觀的闡述了PCR方法，1976年一種從嗜熱水生菌（Thermus aquaticus）分離得到的熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶的應(yīng)用大大增加了PCR的效率。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則是源于由Saiki和Mullis等人于1988年發(fā)表在Science上的一篇論文。
到如今，PCR方法愈發(fā)趨向自動化，并從中衍生出更多的新技術(shù)方法，可以說，PCR技術(shù)是支撐現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展的一塊重要基石。這種技術(shù)的廣泛應(yīng)用催生了一個龐大的市場，多個公司均有各種類型的商品化PCR儀出售。
PCR原理：DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的作用下，以單鏈為模版，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成新的單鏈，與模版配對成為雙鏈分子拷貝。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計與模板DNA的5’端結(jié)合的兩條引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制，多次重復(fù)“變性解鏈-退火-合成延伸”的循環(huán)就可以以幾何級數(shù)大量擴增特定的基因。而發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該類酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。
從PCR原理可以看出，PCR儀的關(guān)鍵是升降溫的步驟?，F(xiàn)在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實驗如何在3個水浴鍋中完成的趣聞。經(jīng)過不斷改進，今天的PCR已經(jīng)越來越完善和智能化。
PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類：
PCR擴增儀和實時熒光定量PCR儀，普通的PCR擴增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴增功能的原位PCR儀等等。
一、溫度控制
對普通PCR儀來說，溫度控制主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度，對梯度PCR儀來說，除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。
溫度的準確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對于PCR反應(yīng)而言zui重要的莫過于溫度控制的準確性，由于PCR是一個幾何級數(shù)擴增的過程，擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結(jié)果，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。
溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進行反應(yīng)結(jié)果的一致性。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)有時用同樣的樣品，同樣的PCR反應(yīng)程序，zui后的結(jié)果竟然差異非常明顯，或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔，就是因為過往反復(fù)的教訓(xùn)和認真的思索得出了這樣的結(jié)論，PCR儀的溫度均勻性不好，特別是zui外周的樣品孔情況更差，很有可能影響實驗結(jié)果-即“位置的邊緣效應(yīng)”會影響結(jié)果的可重復(fù)性。正是這種位置效應(yīng)對定量PCR的結(jié)果的影響更為明顯。
溫度控制除了度，還有一個廠家喜歡大力宣傳的指針-升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應(yīng)進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時間，能提高PCR反應(yīng)特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對穩(wěn)定耐用的機械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導(dǎo)體。除了機械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導(dǎo)熱性。
作為用戶來說，當然更愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到，而內(nèi)在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因為樣品管與基座接觸的緊密性、導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度?，F(xiàn)在的PCR儀一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應(yīng)管溫控模式（tube-control）。在模塊溫控模式下，機器根據(jù)探測器直接探測的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺）的溫度進行控制，這種模式適用于長時間的靜態(tài)孵育（如連接、 切、去磷酸化等）。反應(yīng)管溫控模式實際上是一種仿真試管/PCR板的溫控模式，根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度由計算器計算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進行控制。一般說來，管溫控更為準確，因為管內(nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預(yù)設(shè)溫度。特別是PCR反應(yīng)中的孵育過程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用只有模塊溫控模式的話，反應(yīng)混合物孵育的時間與程序設(shè)定的時間會有相當大的差距。而反應(yīng)管控制的算法能自動補償時間，而且適合各種類型的反應(yīng)管，確保反應(yīng)混俁物按照程序設(shè)定的時間維持預(yù)設(shè)溫度。
梯度PCR：對于一個PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算zui適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能"P"出來結(jié)果，細微的變化對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題-在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化-對于多種聚合酶混合擴增來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的*反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
對于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導(dǎo)致在梯度模式下得出的*條件與標準模式下單獨做的結(jié)果出現(xiàn)差異。
二、儀器的功能性和人性化設(shè)計
熱蓋：現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設(shè)為105℃，使樣品管頂部的溫度達到105℃左右，蒸發(fā)的反應(yīng)液就不會產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應(yīng)體積，這樣用戶就無需再向反應(yīng)管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼操作的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心，因為壓力到達時沒有明顯的提示，用戶需要根據(jù)經(jīng)驗將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過松，熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；如果過緊，則會導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機械故障。
樣品基座：PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。
軟件：新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕，顯示實時信息，，記憶存儲多個程序、自動斷電保護等都有助于實驗室中的復(fù)雜環(huán)境使用。
綜合考慮，一臺PCR儀選購的關(guān)鍵還是在于用戶自己的要求，有些功能可能都用不上或很少用，用戶需要仔細斟酌，畢竟是一分錢一分貨。
1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上發(fā)表文章準確、精煉、客觀的闡述了PCR方法，1976年一種從嗜熱水生菌（Thermus aquaticus）分離得到的熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶的應(yīng)用大大增加了PCR的效率。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則是源于由Saiki和Mullis等人于1988年發(fā)表在Science上的一篇論文。
到如今，PCR方法愈發(fā)趨向自動化，并從中衍生出更多的新技術(shù)方法，可以說，PCR技術(shù)是支撐現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展的一塊重要基石。這種技術(shù)的廣泛應(yīng)用催生了一個龐大的市場，多個公司均有各種類型的商品化PCR儀出售。
PCR原理：DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的作用下，以單鏈為模版，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成新的單鏈，與模版配對成為雙鏈分子拷貝。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計與模板DNA的5’端結(jié)合的兩條引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制，多次重復(fù)“變性解鏈-退火-合成延伸”的循環(huán)就可以以幾何級數(shù)大量擴增特定的基因。而發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該類酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。
從PCR原理可以看出，PCR儀的關(guān)鍵是升降溫的步驟?，F(xiàn)在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實驗如何在3個水浴鍋中完成的趣聞。經(jīng)過不斷改進，今天的PCR已經(jīng)越來越完善和智能化。
PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類：
PCR擴增儀和實時熒光定量PCR儀，普通的PCR擴增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴增功能的原位PCR儀等等。
一、溫度控制
對普通PCR儀來說，溫度控制主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度，對梯度PCR儀來說，除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。
溫度的準確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對于PCR反應(yīng)而言zui重要的莫過于溫度控制的準確性，由于PCR是一個幾何級數(shù)擴增的過程，擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結(jié)果，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。
溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進行反應(yīng)結(jié)果的一致性。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)有時用同樣的樣品，同樣的PCR反應(yīng)程序，zui后的結(jié)果竟然差異非常明顯，或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔，就是因為過往反復(fù)的教訓(xùn)和認真的思索得出了這樣的結(jié)論，PCR儀的溫度均勻性不好，特別是zui外周的樣品孔情況更差，很有可能影響實驗結(jié)果-即“位置的邊緣效應(yīng)”會影響結(jié)果的可重復(fù)性。正是這種位置效應(yīng)對定量PCR的結(jié)果的影響更為明顯。
溫度控制除了度，還有一個廠家喜歡大力宣傳的指針-升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應(yīng)進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時間，能提高PCR反應(yīng)特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對穩(wěn)定耐用的機械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導(dǎo)體。除了機械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導(dǎo)熱性。
作為用戶來說，當然更愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到，而內(nèi)在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因為樣品管與基座接觸的緊密性、導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度?，F(xiàn)在的PCR儀一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應(yīng)管溫控模式（tube-control）。在模塊溫控模式下，機器根據(jù)探測器直接探測的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺）的溫度進行控制，這種模式適用于長時間的靜態(tài)孵育（如連接、 切、去磷酸化等）。反應(yīng)管溫控模式實際上是一種仿真試管/PCR板的溫控模式，根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度由計算器計算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進行控制。一般說來，管溫控更為準確，因為管內(nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預(yù)設(shè)溫度。特別是PCR反應(yīng)中的孵育過程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用只有模塊溫控模式的話，反應(yīng)混合物孵育的時間與程序設(shè)定的時間會有相當大的差距。而反應(yīng)管控制的算法能自動補償時間，而且適合各種類型的反應(yīng)管，確保反應(yīng)混俁物按照程序設(shè)定的時間維持預(yù)設(shè)溫度。
梯度PCR：對于一個PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算zui適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能"P"出來結(jié)果，細微的變化對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題-在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化-對于多種聚合酶混合擴增來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的*反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
對于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導(dǎo)致在梯度模式下得出的*條件與標準模式下單獨做的結(jié)果出現(xiàn)差異。
二、儀器的功能性和人性化設(shè)計
熱蓋：現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設(shè)為105℃，使樣品管頂部的溫度達到105℃左右，蒸發(fā)的反應(yīng)液就不會產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應(yīng)體積，這樣用戶就無需再向反應(yīng)管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼操作的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心，因為壓力到達時沒有明顯的提示，用戶需要根據(jù)經(jīng)驗將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過松，熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；如果過緊，則會導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機械故障。
樣品基座：PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。
軟件：新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕，顯示實時信息，，記憶存儲多個程序、自動斷電保護等都有助于實驗室中的復(fù)雜環(huán)境使用。
綜合考慮，一臺PCR儀選購的關(guān)鍵還是在于用戶自己的要求，有些功能可能都用不上或很少用，用戶需要仔細斟酌，畢竟是一分錢一分貨。