您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
梯度PCR儀常見問題及現(xiàn)場解決方案
閱讀：2441 發(fā)布時(shí)間：2018-1-29
梯度PCR儀常見問題及現(xiàn)場解決方案如下：
1、梯度PCR儀在產(chǎn)物序列中引入了錯(cuò)誤，這大多是由于聚合酶忠實(shí)性低或者循環(huán)數(shù)太多，這時(shí)需要使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，同時(shí)降低循環(huán)數(shù)。此外，四種dNTP的濃度不同也會(huì)出現(xiàn)該問題，此時(shí)應(yīng)制備新的濃度相同的dNTP混合物。
2、PCR跑膠，目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象。出現(xiàn)這樣的問題，則需要進(jìn)行細(xì)致的分析，因?yàn)橐鹪搯栴}的可能很多?？上葯z查是否模板質(zhì)量問題，如有降解等，模板應(yīng)避免反復(fù)凍融。也有可能是抽提RNA時(shí)有污染，則需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特異性擴(kuò)增引發(fā)該問題，可提高退火溫度，少循環(huán)次數(shù)。電泳緩沖液時(shí)間太長，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時(shí)電壓太高、電泳液過久沒換，電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問題。如果不是由上述原因引起，則進(jìn)一步檢查加樣量是否過大，制膠過程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴(kuò)增的條件不合適。針對具體原因再采取相應(yīng)的措施。
3、梯度PCR儀產(chǎn)物何時(shí)需要用凝膠純化，何時(shí)不需要？當(dāng)凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶時(shí)，則不需要使用凝膠純化。當(dāng)可見其他雜帶時(shí)，則可能是積累了大量引物的二聚體，在克隆前需要做凝膠純化。
