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如何選擇WB內(nèi)參抗體
閱讀：1028 發(fā)布時間：2022-11-23免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質印跡（Western blotting），是根據(jù)抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析 。結合化學發(fā)光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。
WB檢測之內(nèi)參抗體
Western Blot檢測方法不僅能檢測靶蛋白存在與否， 還能比較不同條件下或者不同組織中靶蛋白的相對表達量，可作為蛋白表達水平最直接的證據(jù)。在WB實驗中有眾多不確定因素影響靶蛋白表達水平的測定，如方法學本身性質、操作誤差等。為準確衡量靶蛋白表達水平，需要精確一致的上樣量，使用內(nèi)參的意義即是保證上樣量的一致。內(nèi)參即內(nèi)部參 照(Internal Control) ， 對哺乳動物細胞一般指管家基因的表達蛋白(Housekeeping Proteins) 。此類蛋白在各組織和細胞中的表達相對恒定， 可作為檢測蛋白表達水平變化的參照物。當內(nèi)參條帶亮度基本一致時，基本可以確定上樣量是一致的，通常采用比較靶蛋白和內(nèi)參蛋白條帶亮度比值來進行相對定量。
WB實驗中涉及到的蛋白-抗體結合是一個復雜的活性生物大分子間的相互作用，眾多因素都會影響實驗的結果。例如時間、溫度、濃度、離子強度等。
內(nèi)參使用方法
1.標記內(nèi)參：酶標的內(nèi)參抗體可避免二抗結合總蛋白中某些免疫球蛋白產(chǎn)生的雜帶，使用時只需在二抗孵育時加入酶標內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。
2.普通內(nèi)參：當靶蛋白分子量與所選內(nèi)參分子量相差不大時，可先對靶蛋白進行顯色檢測， 然后用Strip緩沖液洗掉膜上抗體， 重新對內(nèi)參蛋白進行顯色檢測。當靶蛋白分子量與所選內(nèi)參分子量相差較明顯時，可對轉膜預染，根據(jù)蛋白質分子量將膜剪為兩部分并分開進行靶蛋白和內(nèi)參蛋白的顯色檢測。內(nèi)參抗體選擇常用的蛋白內(nèi)參有GAPDH和β-actin或β-tubulin， 內(nèi)參的選擇原則是選擇與靶蛋白分子量相差5KD以上的內(nèi)參，對不同的樣本則需要根據(jù)實際情況進行選擇。
1.根據(jù)物種選擇
哺乳動物來源的組織或細胞樣本通常選擇β-actin、 β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H 3、Na'/K'-ATPase等。植物來源的樣本常選擇plant actin、Rubisco等。對于其他研究稀少的物種可參考報導的文獻進行選擇。以GAPDH為例， 抗GAPDH單抗(ABGENT， clone6C 5) 能夠與非洲蟾蜍、猴、豬、羊、狗、貓、魚、蛙、雞、兔、小鼠、大鼠及人組織來源的GAPDH反應， 但不能與酵母GAPDH反應。
2根據(jù)組織類型選擇
以肌動蛋白actin為例， 肌動蛋白actin在不同物種之間高度保守， 且同一物種類型actin的序列相似性大于90%， 使其很難獲得特異性較好的抗actin抗血清。但物種不同類型actin的N段序列相似性僅50~60%， 故Ｎ端序列常被用來制備抗actin體。脊椎動物肌動蛋白分為α、 β和y三種類型， a型分布于心肌、橫紋肌細胞利肌細胞中， y型分布于平滑肌細胞和非肌細胞中，β型分布于非肌細胞中，共六種蛋白， 不同廠商生產(chǎn)抗B-actin抗體過程中選擇的免疫區(qū)段在不同型actin之間的否影響到抗體的組織特異性。選用β-act inN端的16個氨基酸序列制備的單多抗占數(shù)， 這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用β-act inC端16個氨序列制備的抗體則可以在肌肉細胞中檢測到actin的信號。
3.根據(jù)蛋白組分選擇
提取細胞蛋白組分過程中，胞漿蛋白通常是最先提取出來的。離心全細胞裂解液的上清含胞漿蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，繼續(xù)加大裂解程度即可提取到胞白，最后才能提取到胞膜蛋白。通過特殊的方法還可以從胞漿蛋白中提取到線粒體蛋葉綠體蛋白等。針對不同的細胞組分需要選擇不同的內(nèi)參抗體。
| 類目 | 內(nèi)參 | 觀測分子量(Kda) |
|---|---|---|
| 細胞總蛋白 | GAPDH | 36 |
| 細胞總蛋白 | β-actin | 42 |
| 細胞總蛋白 | β-tubulin | 55 |
| 胞膜蛋白 | Na'/K'-ATPase | 100 |
| 胞膜蛋白 | Integrin | 90-160 |
| 胞漿蛋白 | caveolin-1 | 20-24 |
| 胞漿蛋白 | actin | 42 |
| 胞漿蛋白 | tubulin | 50 |
| 線粒體蛋白 | VDAC1 | 35-37 |
| 線粒體蛋白 | COX IV | 17 |
| 胞核蛋白 | Histone H3 | 18 |
| 胞核蛋白 | PCNA | 36 |
| 胞核蛋白 | Lamin A/C | 74 |
| 胞核蛋白 | caveolin | 20-24 |
| 胞核蛋白 | TATA binding protein | 鼠源：33-36 人源：37-43 |
| 胞核蛋白 | Pax-5 | 45 |
| 胞核蛋白 | Rb | 110 |
| 胞核蛋白 | c-Jun | 43,48 |
| 胞核蛋白 | c-Fos | 62 |
| 胞核蛋白 | nucleoporin p62 | 61 |
| 胞核蛋白 | c-Fos | 62 |
| 胞核蛋白 | nucleoporin p62 | 61 |
在選擇細胞總蛋門內(nèi)參時.GAPDH、P-actin, tubulin^種內(nèi)參冋時發(fā)生變化的情況 很少，如出現(xiàn)這種情況.可用胞核內(nèi)參戻至線粒體內(nèi)參代替。另外.不同的實驗冃的應選 樣不同的內(nèi)參，例如檢驗質核分離效果應選擇胞漿蛋白內(nèi)參actin.抽提的核組分中檢測 不到actin則表示質核分離效果較好。
總之,內(nèi)參的選擇要根據(jù)實際情況而定.不僅要考慮到物種、組織、組分等因素。還需要考慮到實際的實驗設計。如實驗設計中包括組織缺氧、糖尿病等因素變量.則不適宜選擇GAPDH作內(nèi)參，研究細胞增殖的相關實驗中則不適宜選c-Jun作內(nèi)參.在凋亡實驗中則要避免使用TBP、Lamin等。