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轉(zhuǎn)化細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式
閱讀：894 發(fā)布時間：2017-7-13轉(zhuǎn)化細胞深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。
一、分批式培養(yǎng)（batch culture） 是細胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機械攪拌式生物反應(yīng)器，將細胞擴大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進行培 養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當?shù)臅r間，一次性收獲細胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。
該方式的特點:
操作簡單。培養(yǎng)周期短，染菌和細胞突變的風險小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與外部環(huán)境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進行其他任何控制，因此操作簡單，容易掌握；
直觀反映細胞生長代謝的過程。因培養(yǎng)期間細胞生長代謝是在一個相對固定的營養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營養(yǎng)成分,因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝基礎(chǔ)條件或"小試"研究常用的手段；
可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡單，對設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器(Genetech)規(guī)模可達12000L。
分批培養(yǎng)過程中，細胞的生長分為五個階段：延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期，見圖1。分批培養(yǎng)的周期時間多在3-5天，細胞生長動力學 表現(xiàn)為細胞先經(jīng)歷對數(shù)生長期（48-72h）細胞密度達到zui高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗劫或代謝毒副產(chǎn)物的累積細胞生長進入衰退期進而死亡，表現(xiàn)出典型的生長 周期。收獲產(chǎn)物通常是在細胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進行。
二、流加式培養(yǎng)（feeding culture）
1、流加式培養(yǎng)是在批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細胞，細胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終 體積的1/2～1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細胞持續(xù)生長至較高的密度，目標產(chǎn)品達到較高 的水平，整個培養(yǎng)過程沒有流出或回收，通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反應(yīng)體系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目標蛋白。
2、流加培養(yǎng)特點：
流加培養(yǎng)細胞生長速率、營養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。
培養(yǎng)過程以低稀釋率流加，細胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時間較長，總細胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。
流加培養(yǎng)過程須掌握細胞生長動力學，能量代謝動力學，研究細胞環(huán)境變化時的瞬間行為。流加培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基的設(shè)計和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。
在工業(yè)化，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放大。
流加培養(yǎng)是當前動物細胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢的培養(yǎng)工藝，也是近年來動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營 養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進行流加的時間多在指數(shù)生長后期，細胞在進入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。可以添加一次，也可添加多次，為了追求更高的細胞密度往往 需要添加一次以上，直至轉(zhuǎn)化細胞密度不再提高；可進行脈沖式添加，也可以降低的速率緩慢進行添加，但為了盡可能的維持相對穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境，后者采用較多； 添加的成分比較多，凡是促細胞生長的物質(zhì)均可以進行添加。流加的總體原則是維持細胞生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營養(yǎng)成分即不過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成 營養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用；也不缺乏導致細胞生長抑制或死亡。
3、流加工藝中的營養(yǎng)成分主要分為三大類：
葡萄糖：葡萄糖是細胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。
谷氨酰胺：谷氨酰胺是細胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；
大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是zui常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。
氨基酸、維生素及其他：主要包括營養(yǎng)必需氨基酸、營養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分 如膽堿。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進行添加時，不溶性氨基 酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢連續(xù)流加。
4、流加式培養(yǎng)分為兩種類型：單一補料分批式培養(yǎng)和反復補料分批式培養(yǎng)。
單一補料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時期，開始連續(xù)補加濃縮營養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達到生物反應(yīng)器的zui大操作容積，停止補加，zui后將細胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時間內(nèi)。
反復補料分批式培養(yǎng)是在單一補料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個一定時間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過反應(yīng)器的zui大操作容積，從而在理論上可以延長培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。
三、半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture）
1、半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。
這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長至一定的密度，在細胞生長至zui大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體 積的1/2~3/4，以維持細胞的指數(shù)生長狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加?；蛘咴诩毎鲩L和產(chǎn)物形成過程中，每隔一定時間，定期取出部分培養(yǎng) 物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培 養(yǎng)，從而可維持反復培養(yǎng)，而無需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當高的接種量，經(jīng)過幾次 的稀釋、換液培養(yǎng)過程，轉(zhuǎn)化細胞密度常常會提高。
2、半連續(xù)式特點：
培養(yǎng)物的體積逐步增加；
可進行多次收獲；
細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。
該操作方式的優(yōu)點是操作簡便，效率高，可長時期進行，反復收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養(yǎng)和藥品中被廣泛應(yīng)用。