蛋白純化是生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)，用于從復(fù)雜的生物樣品中分離出目標(biāo)蛋白質(zhì)。以下是對幾種常見蛋白純化方法的詳細(xì)描述：
1. 沉淀法
- 鹽析：通過增加溶液中的離子強(qiáng)度，降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其沉淀。常用的鹽包括硫酸銨、氯化鈉等。
- 有機(jī)溶劑沉淀：使用有機(jī)溶劑如乙醇或丙酮，降低蛋白質(zhì)的溶解度，促使其沉淀。
- 酸堿沉淀：調(diào)節(jié)溶液的pH值，使蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近沉淀。
2. 層析法
- 凝膠過濾層析：根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離，大分子蛋白質(zhì)先被洗脫出來。
- 離子交換層析：根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷差異進(jìn)行分離，通過改變流動相的pH值或鹽濃度，使蛋白質(zhì)與離子交換劑結(jié)合或解離。
- 親和層析：利用蛋白質(zhì)與特定配體的特異性結(jié)合進(jìn)行分離，如酶與底物、抗體與抗原的結(jié)合。
3. 電泳法
- SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：在變性條件下，根據(jù)蛋白質(zhì)的亞基大小進(jìn)行分離。
- 等電聚焦電泳(IEF)：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離，蛋白質(zhì)在pH梯度中遷移至其等電點(diǎn)處聚焦。
- 二維電泳：結(jié)合SDS-PAGE和IEF，先進(jìn)行IEF分離，再進(jìn)行SDS-PAGE分離，提高分辨率。
4. 超濾和透析
- 超濾：通過半透膜，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離，小分子物質(zhì)通過膜，大分子蛋白質(zhì)被截留。
- 透析：利用半透膜，通過擴(kuò)散作用去除溶液中的小分子雜質(zhì)，如鹽類、溶劑等。
5. 高效液相色譜(HPLC)
- 反相HPLC：根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行分離，非極性蛋白質(zhì)在柱上保留時間較長。
- 尺寸排阻HPLC：根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離，類似于凝膠過濾層析。
- 離子交換HPLC：根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷差異進(jìn)行分離，類似于離子交換層析。
6. 磁性分離
- 磁性親和層析：將親和配體固定在磁性顆粒上，通過磁場快速分離結(jié)合有目標(biāo)蛋白質(zhì)的磁性顆粒。
7. 溫度循環(huán)
- 熱變性循環(huán)：利用蛋白質(zhì)在不同溫度下的穩(wěn)定性差異，通過加熱和冷卻循環(huán)，使雜質(zhì)蛋白質(zhì)變性沉淀，而目標(biāo)蛋白質(zhì)保持活性。
8. 金屬螯合親和層析
- 金屬螯合層析：利用蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基與金屬離子的親和性進(jìn)行分離，常用于純化帶有His標(biāo)簽的重組蛋白。
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