1. 亮發(fā)光桿菌和培養(yǎng)基從穩(wěn)定運行的生物脫硫脫氮 EGSB-DSR 反應(yīng)器的不同高度采集污泥。將采集的樣品 50 mL (固體 5.0 g)放入 500 mL 滅菌的錐形瓶中，加入無菌水稀釋到 250 mL，放入玻璃珠 20−25 個，在搖床中以 220 r/min 振蕩 24 h。將菌膠團或土壤顆粒振碎，制成菌懸液。采用 Hungate 厭氧滾管技術(shù)篩選功能微生物，培養(yǎng)基的配方(g/L)：Na2S·9H2O 0.50，無水乙酸鈉 0.28，NaHCO3 1.50，NH4Cl 0.05， KNO3 0.15， K2HPO4 0.05。采用 4 mol/L NaOH 將 pH 調(diào)至 7.5。在配制培養(yǎng)基過程中全程采用80%氮氣吹脫以保證厭氧環(huán)境。制作固體培養(yǎng)基時，在液體培養(yǎng)基中加入 2%左右的瓊脂。
2. 菌種的分離與篩選吸取 1 mL 的污泥菌懸液，用無菌水稀釋至 10–4。接入固體培養(yǎng)基中在恒溫培養(yǎng)箱 30 ºC 培養(yǎng) 5 d 至培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落為止。挑取培養(yǎng)基上的單菌落轉(zhuǎn)入液態(tài)分離培養(yǎng)基，進(jìn)行擴大培養(yǎng)，在恒溫培養(yǎng)箱 30 ºC 培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為 5 d 左右，培養(yǎng)基出現(xiàn)白色混濁為宜。用接種針粘取液態(tài)培養(yǎng)基的菌種，在固態(tài)培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)。在恒溫培養(yǎng)箱 30 ºC 進(jìn)行培養(yǎng)，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)入液態(tài)培養(yǎng)基中。重復(fù)以上分離步驟 5 個周期，直至分離出單一菌落。
3. 菌株 A2 形態(tài)特征以及 16S rRNA 基因的測序鑒定采用透射電鏡的方法觀察菌株的形態(tài)特征：取純化的液體培養(yǎng)物一滴置于銅網(wǎng)上，15−20 min 后取銅網(wǎng)于 2%的磷鎢酸鈉溶液中負(fù)染色 40 s，取出銅網(wǎng)置于干燥的濾紙上劃線分區(qū)，晾干。將此銅網(wǎng)置于透射電鏡的樣品室，觀察細(xì)菌形貌。之后進(jìn)行革蘭氏染色實驗。采用天根公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株 A2 的細(xì)菌基因組 DNA，然后用正向引物 F8 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和反向引物 R1492 (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行細(xì)菌的 16S rRNA PCR 擴增，反應(yīng)體系(50 μL)：模板 DNA 3 μL，正向引物(20 pmol/L) 2 μL，反向引物(20 pmol/L) 2 μL，dNTP mixture (1.95 mmol/L) 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 1.5 μL，10×Buffer 3 μL，ddH2O 36 μL。 PCR 擴增條件：95 °C 5 min；94 °C 1 min，60 °C 30 s， 72 °C 1 min，35 個循環(huán)；72 °C 10 min；4 °C 保存。將 PCR 擴增的產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對分析，并用軟件 Mega 5.0 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。
4. 菌株 A2 的異養(yǎng)反硝化脫硫特性將亮發(fā)光桿菌對數(shù)期的菌液 10 mL 轉(zhuǎn)接入配制好的液體培養(yǎng)基 50 mL 中，立即用離子色譜和分光光度計檢測 S2–、S2O3 2–、SO4 2–、NO3 – 、NO2 – 和碳源濃度并記錄，再按原篩選的條件進(jìn)行培養(yǎng)。每隔 3 h 檢測一次，直至這 6 個指標(biāo)的濃度不再變化。
Gambogic acid 藤黃酸 2752-65-0 20mg
Leucoside 堪非醇3-O-桑布雙糖苷 27661-51-4 20mg
Scularin 野黃芩苷 27740-01-8 20mg
Geniposidic acid 京尼平苷酸 27741-01-1 20mg
Isosteviol 異甜菊醇 27975-19-5 20mg
Cimigenoside 升麻環(huán)氧醇苷 27994-11-2 20mg
亮發(fā)光桿菌
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