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非洲豬瘟快速檢測(cè)設(shè)備價(jià)格PCR儀廠家
非洲豬瘟快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室方案
用于非洲豬瘟病毒檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，推薦配置以下設(shè)備：II級(jí)生物安全柜、高速離心機(jī)、低溫冰箱、高壓蒸汽滅菌器、恒溫水浴鍋、組織勻漿儀、移液器、PCR儀、迷你型離心機(jī)。同時(shí)，建議實(shí)驗(yàn)室配備合適的個(gè)人防護(hù)用品，如防護(hù)服、手套、口罩等。
非洲豬瘟快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟：
1.樣品處理
血液樣品直接用；
淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體樣品，用無(wú)菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0 g于研缽中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1萬(wàn)單位青霉素和1萬(wàn)單位鏈霉素）混勻（樣品不足2.0 g按1:5比例加PBS），對(duì)處理的待檢樣品置70℃，30 min滅活后，3 000 r/min，4 ℃離心5 min，取上清液，編號(hào)備用；血球粉處理同上，只不過(guò)省掉研磨步驟。
2.豬瘟檢測(cè)樣品存放
采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24 h；若需長(zhǎng)期保存，須放置-80 ℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。
3.非洲豬瘟快速檢測(cè)操作步驟
3.1 病毒DNA的提?。ㄊ褂肁盒）
（1）待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的份數(shù)總和用n表示，取n個(gè)滅菌的1.5 mL離心管，逐管編號(hào)。
（2）每管加入Buffer A 500 L。
（3）每管分別加入已處理的待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各200 L，充分混勻，室溫放置10分鐘。
（4）取與上述離心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，編號(hào)。將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至DNase-Free吸附柱，（為避免堵塞吸附柱，盡量不要吸懸浮雜質(zhì)）。
（5）13000 r/min室溫離心30 sec。
（6）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。
（7）吸附柱內(nèi)加入600 μL Buffer B，13000 r/min離心30 sec。
（8）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。
（9）重復(fù)步驟（7），（8）。
（10）13000 r/min空柱離心2 min，去除殘留液。
（11）將每個(gè)吸附柱分別移入新的1.5mL離心管中，向柱*加入50 μL Buffer C，室溫靜置1 min，13000 r/min離心30 sec，離心管中液體即為模板DNA。獲得的DNA溶液，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁馓崛〉腄NA須在2 h內(nèi)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，若需長(zhǎng)期保存須放置-80 ℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融）。
3.2 非洲豬瘟快速檢測(cè)用熒光PCR擴(kuò)增（使用B盒）
（1）從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、Taq酶，室溫融化后，2 000 r/min離心5 sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n = 樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照），每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要20 μL 熒光PCR反應(yīng)液和0.5 μL Taq酶。計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積小管中，充分混合均勻后，向每個(gè)PCR管中各分裝20 μL。
（2）分別向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制備的DNA溶液各5μL，蓋緊管蓋，500 r/min 離心30 sec。
（3）將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，作好標(biāo)記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：
*階段，預(yù)變性95℃/3 min；第二階段，95℃/15 sec，52℃/10 sec，60℃/35 sec共45個(gè)循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的60℃延伸時(shí)進(jìn)行。
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