丁型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hepatitis D Virus(HDV)

產(chǎn)品及特點

丁型肝炎病毒（Hepatitis Delta Virus，HDV）是一種缺陷病毒，必須在 HBV 或其他嗜肝 DNA 病毒的輔助下才能復(fù)制增殖。HDV 與 HBV 重疊感染后， 可促使肝損害加重，并易發(fā)展為慢性活動性肝炎、肝硬化和重型肝炎。HDV 的 感染呈世界性分布，但主要分布于南意大利和中東等地區(qū)，主要通過輸血、密切 接觸和母嬰傳播。HDV 給人類健康造成重大威脅，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具 有重要的意義。本產(chǎn)品基于 PCR 原理開發(fā)。它具有下列特點：

1.一站式，用于不需要單獨準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據(jù) HDV 的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。 
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

丁型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒??規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供RNA段作為陽性對照。

自備試劑  樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非 常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑 盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣 品做陽性對照，只提供無傳染性的的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。 二、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照 梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。

7. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。 

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）

8. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照，6 個用于 RT-PCR 陽性對照。

9. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分： 

10. 上機后按下面參數(shù)進行 RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理

10. 如果PCR陽性對照和PCR陰性對照均得到預(yù)期陽性和陰性結(jié)果，則說明PCR 有效，可以進行后續(xù)分析。以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果 PCR 陽性對照或 PCR 陰性對照任何一個沒有得到預(yù)期陽性和陰性結(jié)果， 則說明 PCR 實驗無效或污染，不需要進行后續(xù)分析，請跟廠家聯(lián)系。

12. 如果樣品制備陽性對照或樣品制備陰性對照均得到預(yù)期陽性和陰性結(jié)果，說 明樣品制備操作有效，實驗結(jié)果有效。

13. 如果樣品制備陽性對照或樣品制備陰性對照任何一個沒有得到預(yù)期結(jié)果（如 樣品制備陽性對照無擴增，或樣品制備陰性對照有擴增），說明樣品制備操作 無效或有污染，實驗結(jié)果無效，需要重復(fù)樣品制備過程或請跟廠家聯(lián)系。