導讀：藥物研發(fā)一直是個繁瑣的過程，化學家們需要篩選千百種化學分子，才可能找出有效的藥物。DNA技術可以大大加快這一過程。過去幾年來，藥物化學家通過用DNA標記化學分子，形成分子的二維碼，從而提高藥物研發(fā)成功率。
麻省沃爾瑟姆市(Waltham, Massachusetts)的一座鋼筋混泥土建筑的二樓，一個實驗室冰箱里的塑料盒中，包含著無數(shù)種化學分子。這些分子是葛蘭素史克制藥公司(GlaxoSmithKline，GSK)合成的帶DNA標簽的分子，數(shù)目達到萬億種——這是銀河系恒星數(shù)目的10倍。
各大制藥公司和生物工程公司都在采用這種DNA編碼分子庫來迅速篩選能與疾病相關蛋白結(jié)合的分子，尤其是能與那些目前難以靶向的蛋白結(jié)合的藥物。這種篩選方法比傳統(tǒng)篩藥方式更迅速，更便宜?；A科學研究者也可以使用這種方法來探索基本生物學問題，研究酶、受體和細胞通路。
藥物研發(fā)的起始步驟往往是：研究人員合成大量化學分子，然后測試這些分子對目標蛋白的結(jié)合作用。在多孔板的每個孔里加入目標蛋白，然后分別加入各種藥物分子，檢測這些分子對蛋白活力的影響。這種方法被稱為高通量篩選(high-throughout screening，HTS)，主要使用機器自動測試上百萬種化學分子，但仍然耗時耗力還費錢，而且不一定湊效。
過去幾年來，藥物化學家通過用DNA標記化學分子，形成分子的二維碼，從而提高藥物研發(fā)成功率。這些DNA編碼分子庫具有諸多優(yōu)點：首先，研究者并不需要單獨測試每種分子;而是只需把分子分成各種混合物，然后檢測混合物是否對目標蛋白活性有影響。一旦有分子能與目標蛋白結(jié)合，它就很容易被認出來——因為可以檢測它的DNA二維碼。
1992年斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)的分子生物學家Sydney Brenner 和化學家 Richard Lerner提出DNA編碼分子庫這一概念。此后，DNA編碼分子庫一直發(fā)展迅猛。2007年，GSK公司以5500萬美金收購了一家在DNA標簽分子庫研究站處于地位的公司。瑞士巴塞爾的諾華公司和羅氏公司也建立了內(nèi)部DNA標簽分子庫研究項目。多家新興生物科技公司——包括沃爾瑟姆的X-chem、哥本哈根的Vipergen、劍橋的Ensemble制藥公司和瑞士的Philochem——也和學界和工業(yè)界合作，迫切希望使用該技術。
“人們現(xiàn)在明白了，DNA編碼分子庫不是一種時尚，而是可以實現(xiàn)的。” 波士頓阿斯利康公司(X-Chem公司的合作者之一)化學創(chuàng)新中心的執(zhí)行理事Robert Goodnow這樣說到。
DNA編碼分子庫不會取代高通量篩選：由于一些化合物不能使用DNA編碼技術合成，各大公司已在高通量篩選上投入巨資。但DNA編碼分子庫提供了一個快速有效、低成本的互補方案，幫助尋找與新的或具有挑戰(zhàn)性的目標蛋白結(jié)合的分子。例如，尋找泛素連接酶——一種將泛素分子連接到目標蛋白的酶、可作為癌癥治療的靶向分子——的結(jié)合分子。
圖：建立DNA二維碼
大即是美
GSK目前擁有世界上zui大的DNA編碼分子庫：GSK的高通量篩選庫有200萬種分子，而DNA編碼分子庫有1萬億種分子，是高通量篩選庫的50萬倍。
建立DNA編碼庫有幾種方式：zui大的分子庫，如GSK公司，使用 DNA記錄法(圖：建立DNA二維碼)。首先合成化學構建模塊，如氨基酸、胺和羧酸，然后通過化學反應，為它們添加不同的DNA二維碼。將第二個建構模塊加入到混合物中，形成新的小分子，DNA標簽延長。通過連接4個構建模塊，化學家可創(chuàng)造藥物分子。由于建筑模塊的種類有上千種，因此潛在的組合數(shù)目非常巨大。
與傳統(tǒng)高通量篩選相比，化學家必須單獨對每個化合物進行檢測，而DNA編碼庫更易于維護和使用。DNA編碼庫可以存儲在一個單一測試管中，而高通量篩選需要使用機器人把每個分子單獨放到一個測試管中。
但GSK的Chris Arico-Muendel表示，DNA編碼庫zui大的優(yōu)點，是可合成的分子數(shù)量多。對于新或難的目標蛋白，GSK使用DNA編碼庫和高通量篩選的頻率相同，甚至更高。迄今為止，GSK公司使用DNA編碼技術合成的化合物是GSK2256294，能有效阻斷環(huán)氧化物酶，一種參與脂肪分解的酶。該候選藥物是Praecis和GSK的合作成果，已通過1期臨床安全實驗，將進一步評估其在糖尿病、傷口愈合和慢性阻塞性肺病的治療中的效果。Arico-Muendel表示，他們很高興，GSK的DNA編碼庫能發(fā)展這么順利。
隨著化學構建模塊的增多，以及連接方式的增多，DNA編碼庫還會進一步擴大。
X-Chem執(zhí)行官Richard Wagner則認為，在不久的將來，DNA編碼庫不僅變得更大，也能更快進入臨床。傳統(tǒng)的藥物篩選中，藥物化學家有時要花許多年來調(diào)整化合物結(jié)構，讓它們更特異、強效和安全。Wagner表示，可以說，傳統(tǒng)篩藥只是一場概率游戲。相比之下，基因編碼庫的大尺寸意味著，按照概率計算，一些化合物更易進入臨床。盡管這些化合物仍然需要優(yōu)化，但更接近理想分子，需要調(diào)整的幅度更小。
X-Chem的DNA編碼庫有1200億種化合物，并已開始進行實踐。僅僅過了一年，他們就篩選出了候選藥物——一種autotaxin抑制劑，能阻斷一種磷脂轉(zhuǎn)化成另一種磷脂。X-Chem的子公司X-Rx現(xiàn)在計劃在2017年開始纖維變性藥物的臨床試驗。業(yè)界對X-Chem的DNA編碼分子庫的興趣日益高漲：在過去五年中，該公司已與幾大制藥*，包括羅氏、阿斯利康、拜耳、強生、輝瑞、賽諾菲等簽署合作協(xié)議，此外還和多個生物工程公司和學術實驗室建立合作。
定制合成
其他生物公司則采用另一種方法合成分子庫。他們不僅使用DNA標簽來標記分子，也使用DNA標簽作為合成模板。哈佛大學(Harvard University)的化學家David Liu和他的學生開發(fā)了一種DNA模板法，產(chǎn)生環(huán)形分子庫。環(huán)狀分子更大、更穩(wěn)定，能在多個位點與目標分子結(jié)合，增強結(jié)合反應的特異性。(GSK和X-Chem公司都有很大的DNA編碼環(huán)形分子庫。)
圖為Sydney Brenner，與Richard Lerner在1992年提出DNA編碼分子庫的概念。
Liu首先產(chǎn)生單鏈DNA模板，模板包含與化學構建模塊的DNA標簽互補的序列。然后依次往化學反應容器中加入DNA標記的化學構建模塊，依靠DNA堿基配對，使各個構建模塊的DNA標簽與DNA模板結(jié)合。zui后的反應是將各個化學構建模塊連接成環(huán)狀，產(chǎn)生環(huán)形分子和一個長鏈DNA標簽。
構建DNA模板庫需要大量工作，因為研究人員必須為每個分子設計模板，還需要為成千上萬種化學構建模塊設計DNA標簽。因此，DNA模板法產(chǎn)生的分子庫小于DNA記錄法產(chǎn)生的分子庫，但依舊遠大于高通量篩選庫，并且還擁有其他優(yōu)點。在DNA模板法中，科學家們一開始就知道zui終合成的分子有哪些，他們可以純化分子庫，去掉那些標簽錯誤的分子。這增加了篩藥的成功率。相比之下，巨大的DNA記錄分子庫可能仍然包含標簽錯誤的化合物。萬一標簽錯誤的分子與目標蛋白結(jié)合，研究者們就需要浪費大段時間在糾錯上。
Liu的分子庫包含14000種分子，目前已取得一些成功。2014年，他的團隊報道，他們發(fā)現(xiàn)了一種穩(wěn)定的、特異的胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme, IDE，與2型糖尿病有關)小分子抑制劑，在此之前，研究者們花了幾十年尋找和設計IDE抑制劑。Liu等人開始研究IDE在健康和疾病中的作用，幫助尋找其它IDE抑制劑。目前他們正努力把小分子抑制劑轉(zhuǎn)化成臨床藥物。
Liu也篩選了100多種目標蛋白的抑制劑。這些蛋白大多急需小分子抑制劑，來促進相關領域的研究。“我沒有想到，*代分子庫在7年后的今天，仍然能為我們帶來這么多科學發(fā)現(xiàn)。在篩選抑制劑上，我們成果累累。到現(xiàn)在為止，我們發(fā)現(xiàn)了非常多種分子的抑制劑，數(shù)目多到我們無法一一研究。”
盡管如此，Liu仍然不懈發(fā)展第二代DNA模板分子庫，這個分子庫包含256000個環(huán)形分子。Liu在2004年創(chuàng)立了Ensemble Therapeutics公司，該公司的分子庫現(xiàn)在已有1000萬個分子。公司聚焦于尋找免疫檢查點蛋白的抑制劑，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和泛素連接酶。他還授權給諾華公司，開發(fā)靶向炎癥相關蛋白白細胞介素-17的藥物。
快速篩選
一旦分子庫建立成功，就開始了目標蛋白結(jié)合分子的尋找之旅。大多數(shù)研究人員依靠“親和篩選”來找出這些化合物。為此，他們?yōu)榘械鞍滋砑蛹兓瘶撕?，使用純化標簽把結(jié)合了分子的蛋白提取出來。zui后一步是讀取DNA標簽，鑒別與蛋白結(jié)合的小分子。
這種方法的一個優(yōu)點是，僅需一點點目標蛋白，就能得到結(jié)果。在一個項目中，Arico-Muendel想尋找一種不穩(wěn)定的、獲取量很少的蛋白的結(jié)合分子。他說，“把蛋白放在干冰上后，我們很快完成了整個篩選過程。而且我們找到了一些能與該蛋白結(jié)合的分子。”高通量篩選是無法完成這種這類實驗。因為高通量篩選里，目標蛋白必須穩(wěn)定且足量，且要在實驗開始前往千百個孔里加入目標蛋白。
但親和篩選也有其不足。笨重的DNA標簽有時會阻礙分子與目標蛋白的互動，因此一些有效的分子可能被遺漏。但由于DNA編碼庫太大，研究者們通常不太在意這些損失。更大的問題是，小分子和標簽可以結(jié)合到純化柱上，產(chǎn)生假陽性率。純化標簽也會影響目標蛋白的結(jié)構，引入數(shù)據(jù)誤差。
幾個研究小組已經(jīng)找到了解決之道。Vipergen，一家擁有5000萬個分子的DNA模板庫的生物技術公司，采用“粘合劑陷阱”來解決這個問題。
Vipergen公司的執(zhí)行官Nils Hansen表示，你可以凍結(jié)你的蛋白——分子庫混合物，切割成非常小的冰塊。如果冰塊足夠小，每個冰塊只包含一個靶蛋白。在這個尺度上，即使沒有純化，與該靶蛋白結(jié)合的小分子的比例也會增加。Vipergen在水和油乳劑中完成篩選，也能達到同樣的效果。此時，微小的水滴的效果等同于小冰塊。Hansen感慨，“這超酷!”
目前，DNA編碼分子庫用于篩選可溶于水、自由浮動的蛋白的抑制劑。但很多重要的藥物靶點嵌于細胞表面，因此不可能使用傳統(tǒng)的親和篩選法。例如，大約40%的經(jīng)認證藥物的靶點都是細胞膜上感受胞外刺激的G蛋白偶聯(lián)受體。Goodnow指出，膜結(jié)合蛋白的篩選技術在不斷發(fā)展，“但仍然不夠完善”。
一種解決方法是混合DNA編碼分子庫與過表達膜結(jié)合蛋白靶標的完整細胞。小分子可以與細胞表面的目標蛋白結(jié)合。然后，研究者洗去未發(fā)生結(jié)合的分子，加熱細胞，讀取DNA標簽，鑒定有效的小分子。GSK已經(jīng)用這種方法來確定一個受體——該受體在精神分裂癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起重要作用的強效抑制劑。
X-Chem也在膜結(jié)合蛋白藥物篩選中獲得成功。Wagner說，“以前，我們主要篩選可溶性蛋白的抑制劑。但數(shù)據(jù)顯示，我們現(xiàn)在也能篩選相對困難的膜結(jié)合蛋白的抑制劑。” Wagner補充說，隨著DNA編碼庫的不斷擴大，以及新的篩選方法的問世，“DNA編碼庫將成為醫(yī)藥行業(yè)藥物研發(fā)的支柱之一。”
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