過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。

測(cè)定原理：

POD 催化 H₂O₂ 氧化特定底物，在 470nm 有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存；用時(shí)加入 3mL 試劑一充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存；試劑三：液體 3 mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 470nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 測(cè)定前將試劑一、二和三在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上。

3、 樣本測(cè)定表

在微量石英比色皿或 96 孔板中按順序加入上述試劑，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄 470nm 下 30s 時(shí)的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。計(jì)算 ΔA＝A2-A1。

注意：

1、若一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液，在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上，測(cè)定時(shí)加入 10µL 樣本和 240µL 混合液測(cè)

定。

2、如果 ΔA 小于 0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到 5min。如果 ΔA 大于 0.5，可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

POD 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）POD 活性

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

計(jì)算公式：

POD（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =2500×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 POD 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =2500×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =2500×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =5×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.25mL； V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）POD 活性

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.005÷T =5000×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 POD 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個(gè)酶活力單位。POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T =5000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個(gè)酶活力單位。POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =5000×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =10×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.25mL； V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。