L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（L-galacto,4-lactone dehydrogenase，

Gal LDH）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法

50管/48樣

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

L-半乳糖途徑是合成 AsA的主要途徑。Gal   LDH位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi) AsA

生物合成的zui后一步，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一，對(duì)植物體內(nèi) AsA含量的積累起著至關(guān)重

要的作用。

測(cè)定原理：

Gal LDH催化 L-半乳糖內(nèi)酯還原細(xì)胞色素 c（Cyt c），還原型Cyt c在  550nm有吸收峰；測(cè)

定還原型 Cyt c增加速率，來(lái)計(jì)算Gal LDH活性。

自備儀器和用品：

臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入40mL蒸餾水，充分溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水，充分溶解。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL

試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

Gal LDH測(cè)定操作：

1.分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到550nm，蒸餾水調(diào)零。

2.試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3.依次在 1mL玻璃比色皿中加入 100μL上清液、800μL預(yù)熱的試劑二和100μL試劑三，迅

速混勻后于 550nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A=A2﹣A1。

Gal LDH活性計(jì)算公式：

(1).按蛋白濃度計(jì)算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1μmol Cyt c為1個(gè)酶活單位。

Gal LDH (μmol/min/mg prot) =△A÷ε÷d×V反總×106÷（Cpr×V樣）÷T

=289×△A ÷Cpr

(2).按樣本質(zhì)量計(jì)算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原1μmol Cyt c為1個(gè)酶活單位。

Gal LDH (μmol/min/g鮮重)  =△A÷ε÷d×V反總×10⁶÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=289×△A ÷W

ε：還原型 Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×10³L/  mol/cm；d：比色皿光徑(cm)，1cm；V反總：反

應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，

100μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公

司蛋白質(zhì)含量 BCA試劑盒；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)

時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng):

試劑二和試劑三配制好后 3天內(nèi)使用完。