正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

規(guī)格：分光光度法 50 管/48 樣

測(cè)定意義

SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。SDH 是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。此外，為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

測(cè)定原理

SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過(guò)吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原 2,6- 二氯酚靛酚（DCPIP），并且在 600nm 處具有特征吸收峰，通過(guò) 600nm 吸光度的變化，測(cè)定 2．6-DPIP 的還原速度，代表 SDH 酶活性。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：50mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑三：1mL×1 支，-20℃保存； 試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支，4℃保存，臨用前加入 2mL 蒸餾水，用不完的試劑仍 4℃保存； 試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 2mL 蒸餾水，用不完的試劑 4℃保存。

樣本的前處理

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 SDH（此步可選做）。

在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 SDH 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟和加樣表

用蒸餾水調(diào)零后，依次加各試劑到 1 mL 玻璃比色皿中，在加入試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，混勻，在 600 nm 波長(zhǎng)下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 1 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

SDH 活性的計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。SDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T=1508×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=304.6×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。SDH 活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.609×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm； d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL； T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。