動(dòng)物細(xì)胞/組織細(xì)胞核粗提分離試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

        動(dòng)物細(xì)胞/組織細(xì)胞核粗提分離試劑是一種旨在從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的細(xì)胞核細(xì)胞器的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于后續(xù)EMSA、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、核轉(zhuǎn)錄終止（run-off）實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄圖譜分析（profiling）、體外核凋亡檢測(cè)、以及核染色質(zhì)、基因組DNA、核RNA/RNP、組蛋白的純化等實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

    細(xì)胞核是細(xì)胞中大的細(xì)胞器，細(xì)胞核的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用的手段之一。細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和功能的研究，包括細(xì)胞核的系列活動(dòng)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA合成和操作、核雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)機(jī)制、核凋亡等。從任何組織或細(xì)胞分離細(xì)胞核的技術(shù)方法基本上采用：一，通過(guò)機(jī)械或溫和低滲化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過(guò)低速差速離心獲得粗提細(xì)胞核；第三，通過(guò)等密度離心獲得高純度的細(xì)胞核，去除所有細(xì)胞漿成分，例如微粒體、線粒體、神經(jīng)髓鞘成分，尤其是與核膜相連的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   120毫升

裂解液（Reagent B）    50毫升

保存液（Reagent C）     5毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

保存方式

      保存裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent ）嚴(yán)格無(wú)菌操作；有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織和細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

一、動(dòng)物組織細(xì)胞核分離

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入適量的（1克組織需要5毫升）清理液（Reagent A）清洗1次

• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過(guò)夜

• 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的5毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)6）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為500g
• 小心抽去上清液
• 加入200微升預(yù)冷的保存液（Reagent C），混勻沉淀顆粒
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

二、動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞核分離

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的5毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約20下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)6）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為500g
• 小心抽去上清液
• 加入200微升預(yù)冷的保存液（Reagent C），混勻沉淀顆粒
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為10次操作（1克動(dòng)物組織或5 X 10⁷細(xì)胞）
• 所有操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)進(jìn)行
• 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent C）
• 建議使用足夠的組織或細(xì)胞量
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數(shù)為20下（或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以使用臺(tái)酚藍(lán)染色，通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物，觀察細(xì)胞裂解程度和計(jì)量細(xì)胞核（注意：建議使用純化細(xì)胞核臺(tái)酚藍(lán)染色試劑盒——GMS10448）
• 通常1克動(dòng)物組織或5 X 10⁷細(xì)胞的細(xì)胞核得率為50%以上（細(xì)胞核計(jì)數(shù)）

8． 如果需要獲得99％以上純度的細(xì)胞核，建議使用動(dòng)物細(xì)胞/組織細(xì)胞核高純超離分離試劑盒－GMS10100.3

• 本公司提供系列細(xì)胞核分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的細(xì)胞核完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的細(xì)胞核維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶