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染色質(zhì)修飾包括組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，組蛋白多樣性。連同DNA一起調(diào)控表觀遺傳表型。雖然染色質(zhì)修飾在多種生理學過程和人類疾病中都有重要的意義，但是由于此前存在的技術檢測通道有限，無法同時檢測各種免疫細胞亞群特異性marker和各種染色質(zhì)修飾。因此在人類免疫細胞中進行染色質(zhì)研究具有挑戰(zhàn)性。近期出現(xiàn)的一個技術突破——質(zhì)譜流式技術，可以在少量細胞甚至是單細胞中進行四十種以上參數(shù)采集，可以應對這一挑戰(zhàn)。斯坦福大學Alex J. Kuo實驗室利用該技術，設計了進行表觀遺傳研究的Panel Assay——epiTOF，將其運用到免疫細胞的組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾研究上。其成果近期（2018年5月）在Cell上發(fā)表。在文章中，利用epiTOF對人的免疫細胞進行單細胞分析，描述了不同免疫細胞亞群中染色質(zhì)修飾種類和水平概觀。其實驗結果揭示了1根據(jù)染色質(zhì)修飾形態(tài)可將免疫細胞分出特定亞群。2個體和細胞之間的染色質(zhì)修飾多樣性隨著衰老而增加。3與衰老相關的染色質(zhì)修飾變化主要受到非遺傳因素的影響。 這一研究把質(zhì)譜流式技術的應用擴展到表觀遺傳學領域。

該研究選取24位健康人PBMC樣本，在22種主要的免疫細胞亞群中檢測8種組蛋白修飾類型和4種組蛋白（組蛋白類型和修飾類型請見Fig1），每個細胞中采集和分析的參數(shù)達到70種以上。由于質(zhì)譜流式檢測到的數(shù)據(jù)是多參數(shù)和單細胞的，因此可以根據(jù)免疫細胞的染色質(zhì)修飾情況進行表觀遺傳分群。結果顯示，靜息的免疫細胞顯示出亞群特異的染色質(zhì)修飾特征；淋巴來源和骨髓來源的免疫細胞具有各自特異的標記特征；單細胞的染色質(zhì)修飾組成的分子標記可以預測該細胞的類型。作者把24位健康人分為兩組進行研究，每組包括6位25歲以下的年輕人（3男3女）和6位65歲以上的老年人（3男3女），通過年輕人和老年人的染色質(zhì)修飾情況對比發(fā)現(xiàn)，隨著衰老，個體間和細胞間的染色質(zhì)修飾差異性顯著增加。對于19對雙胞胎的染色質(zhì)修飾研究發(fā)現(xiàn)，70%的差異性增加情況是由于環(huán)境因素導致的?？傊@篇文獻開發(fā)了一個高通量多參數(shù)的研究方法，用于人類免疫細胞中進行單細胞水平的染色質(zhì)修飾研究，研究結果揭示了衰老影響表觀遺傳的機制以及自然和營養(yǎng)在衰老的人類細胞中染色質(zhì)動態(tài)中的相關貢獻。

Fig1 文章的整體研究思路和發(fā)現(xiàn)。作者利用質(zhì)譜流式技術，對人免疫細胞樣本中的4種組蛋白，8種組蛋白修飾類型進行研究分析，結果顯示修飾具有細胞類型特異性和譜系特異性。隨著衰老，細胞間和個體間的差異性增加，通過對雙胞胎群體的研究發(fā)現(xiàn)，這一衰老相關的表觀遺傳變化主要是受到非遺傳性因素的影響。

作者首先對免疫細胞亞群中的各種染色質(zhì)修飾概況進行了研究（Fig2，對應原文Fig1C）。染色質(zhì)修飾數(shù)據(jù)的標準化是采用線性回歸模型，利用整體組蛋白表達作為預測變量。數(shù)據(jù)分析集中在修飾水平和差異性。整體變化如Fig2所示。修飾具有亞群特異性，比如，CD4+T細胞和CD8+T細胞表現(xiàn)出相似的修飾表型，NK細胞的所有修飾水平相對于其他亞群都處于低水平。此外，在CD14+ Monocytes中，cleaved H3 Thr22修飾以及PADI4表達水平顯著升高。而組蛋白變體H3.3表達和H3K27me修飾水平下降。逆辛普森多樣性指數(shù)分析（ISDI）顯示cleaved H3 Thr22和H2A.Z修飾具有zui大的樣本間差異性，macroH2A， PADI4，和H2BK120ub顯示出zui小的樣本間差異性等。對于以上發(fā)現(xiàn)，作者采用傳統(tǒng)流式進行了驗證，結果*一致。聚類算法顯示，骨髓來源的免疫細胞相對于淋巴來源的免疫細胞具有以下特征： H3.3和H3K27me3修飾水平降低，cleaved histone H3 Thr22， H3K36me1水平升高， PADI4 表達。此外作者還發(fā)現(xiàn)H3K27me3的賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH1和 EZH2在淋巴前體細胞和T細胞中的表達量遠高于骨髓前體細胞和Monocytes。這個發(fā)現(xiàn)支持了H3K27me3修飾水平區(qū)別決定HSC分化方向的假說。作者隨后進行的ChIP-seq研究結果同樣驗證了這一結論。

Fig2 免疫細胞亞群中的各種染色質(zhì)修飾概況。圖中展示了不同免疫細胞亞群中各種組蛋白修飾的水平和樣本間差異性。

隨后作者對于質(zhì)譜流式所得到的單細胞多參數(shù)數(shù)據(jù)進行了PCA分析，結果顯示，基于染色質(zhì)修飾類型及水平同樣可以將各種免疫細胞亞群區(qū)分開來，其中， 骨髓來源的Monocytes和其他亞群的區(qū)分度更高，這同樣支持了骨髓來源和淋巴來源的免疫細胞染色質(zhì)修飾具有其特異性這一結論（Fig3，對應原文Fig2A）。

Fig3 基于染色質(zhì)修飾類型及水平對免疫細胞進行分群。其中骨髓來源的Monocyte和其他免疫細胞亞群展現(xiàn)出更大的差異性。

得到以上結論后，作者將研究集中在11種T細胞亞群中，檢測了40種染色質(zhì)修飾。基于染色質(zhì)修飾結果的聚類分析自動分出了αβ T細胞和γδT細胞亞群，說明這兩個亞群的染色質(zhì)修飾具有特異性。Na？ve CD4+ T，Na？ve CD8+ T以及Effector，Memory T細胞各自被自動聚類在一起，這說明T細胞亞群的染色質(zhì)修飾具有功能特異性。這些結果顯示，T細胞亞群的染色質(zhì)修飾具有可塑性，很可能是根據(jù)其在獲得性免疫中的特定免疫功能進行重置。與分化初期的Na？ve T細胞相比，在分化終端的Memory T細胞中， H3S10ph（在正在轉(zhuǎn)錄基因的啟動子處會被檢測到）修飾水平顯著上調(diào)。與此同時，常染色質(zhì)相關的H3K27me1和H3K36me1兩種修飾水平也出現(xiàn)上調(diào)，異染色質(zhì)相關的組蛋白修飾H3K27me3， H4K20me3，和H3K9me2修飾水平出現(xiàn)下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)說明Memory T細胞中的染色質(zhì)處于更加易于轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)。與所有CD4+T細胞相比，在Treg中，H3K27me1 和 H3K27ac修飾顯著上調(diào)，H3K27me3修飾水平顯著下調(diào)。預示了在Treg中進行以上修飾生物學研究的重要性。除了T細胞以后，作者對于CD56bright和CD56dim的NK細胞染色質(zhì)修飾也進行了分析，發(fā)現(xiàn)CD56bright NK細胞和CD56dim的NK細胞或者其他淋巴來源的免疫亞群無法聚類在一起，這預示了CD56bright NK細胞與CD56dim的NK細胞很可能來源于不同的干祖細胞（Data not shown，請參考原文Fig3D and Fig3E）。

Fig4 T細胞亞群中，染色質(zhì)修飾概況。T細胞亞群的染色質(zhì)修飾具有功能特異性。

完成在不同細胞亞群中的染色質(zhì)修飾研究以后，作者把研究轉(zhuǎn)向在衰老過程中染色質(zhì)修飾的變化情況。對比了12個25歲以下的年輕人和12個65歲以上的老年人的染色質(zhì)修飾情況（涉及40種染色質(zhì)修飾和20種免疫細胞亞群，共計800種數(shù)據(jù)點），結果顯示隨著衰老，大多數(shù)免疫細胞中的多數(shù)修飾水平均有增加，但是CD45RO+CD197+ central memory CD8+ T細胞中的共檢測了40種修飾，其中34種水平降低。這暗示著central memory CD8+ T細胞中的染色質(zhì)衰老機制很可能是*的。除此之外，作者對于年輕人和老年人的樣本進行了多重t-TEST分析，對比前述800種數(shù)據(jù)點的CV值，結果顯示其中61.8%的數(shù)據(jù)點在老年樣本中呈現(xiàn)了更高的細胞間差異性。這些差異性增加的修飾包括H3K27me3， H3K27me2 H2AK119ub， 這些修飾都是由polycomb抑制性復合物1或者2 (PRC1 或 PRC2)催化（Fig5）。此前有報道顯示PRCs在轉(zhuǎn)錄沉默和染色質(zhì)致密化過程中有重要作用(Margueron and Reinberg， 2011). H3K4me3在多種免疫細胞亞群中隨著年齡的增加沒有發(fā)生顯著變化，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，隨著衰老，H3K27me3 標記的基因的轉(zhuǎn)錄水平變化相對于H3K4me3標記的基因轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出更大的差異性。這一發(fā)現(xiàn)預示了下述模型：隨著衰老而提高的表觀遺傳噪音，尤其是PRC介導的H3K27me3，導致了單細胞之間染色質(zhì)狀態(tài)的差異，并zui終引發(fā)了衰老進程中轉(zhuǎn)錄噪音的增加。

Fig5在衰老過程中染色質(zhì)修飾的變化情況

作者提出的問題是衰老過程中的差異性增加是否由遺傳性因素決定。選取了9對同卵雙胞胎和10對異卵雙胞胎進行研究。利用經(jīng)典的ACE模型分析數(shù)據(jù)得出結論如下：70%的組蛋白差異性取決于非遺傳性因素（其中包括13.5%的共享環(huán)境因素和56.5%的*環(huán)境因素），30%差異性取決于遺傳性因素。其中CD45RO-CCR7+ naive， CD45RO+CCD7+ central memory和CD45RO+CCD7- effector memory CD4+ T 細胞在CD4+ T細胞中的占比由遺傳因素決定。

REFERENCE

PeggieCheung， et al.， Single-Cell Chromatin Modification Profiling Reveals Increased Epigenetic Variations with Aging. Cell， 2018.