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近日，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室朱煥章課題組設(shè)計(jì)并構(gòu)建出只在HIV感染細(xì)胞上才能切除HIV-1前病毒的誘導(dǎo)型鋅指蛋白核酸酶（ZFN-Tat），避免了ZFN持續(xù)表達(dá)可能引起的潛在脫靶效應(yīng)，為該技術(shù)在臨床上安全、有效地應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。相關(guān)研究結(jié)果近日發(fā)表在期刊《Molecular Therapy- Nucleic Acids》；

抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療能顯著改善艾滋病患者的生存率，但該療法并不能治愈病人，其原因是抗病毒yao物僅能抑制復(fù)制，并不能對(duì)感染細(xì)胞基因組中HIV前病毒起作用，即“治標(biāo)不治本”。因此，如何靶向清除整合在免疫細(xì)胞基因組上的HIV前病毒，是目前艾滋病治療研究領(lǐng)域zui富有挑戰(zhàn)性的科學(xué)問題；倘若能使整合的HIV前病毒從靶細(xì)胞基因組上缺失，那么，則可從根本上解決艾滋病不能治愈的問題，實(shí)現(xiàn)“斬草除根”的夢(mèng)想。

目前，基于基因編輯技術(shù)的基因治療大約有20 多個(gè)方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)，效果令人鼓舞，但其安全性問題仍需要考慮，譬如脫靶效應(yīng)和免疫原性。2017 年 5 月 30 日，《自然•方法》（Nature Methods）報(bào)道了來自哥倫比亞大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員發(fā)現(xiàn)，在治愈小鼠相關(guān)疾病遺傳性疾病的同時(shí)，基因編輯常用的工具 CRISPR/Cas9 可能會(huì)造成很多意料之外的基因突變。盡管，該文已撤稿，但技術(shù)本身的潛在脫靶效應(yīng)是存在的。2018年1月，《自然》（Nature）報(bào)道了斯坦福大學(xué)Weinberg博士團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)新研究，發(fā)現(xiàn)七成的健康人體內(nèi)存在Cas9蛋白同源物抗體，近半數(shù)人具有Cas9蛋白同源物的抗原特異性T細(xì)胞。人體會(huì)對(duì)Cas9酶產(chǎn)生免疫反應(yīng)，意味著人體自身的免疫系統(tǒng)可能會(huì)破壞基于CRISPR-Cas9開發(fā)的基因療法。Weinberg博士對(duì)此表示，Cas9只在短時(shí)間內(nèi)開啟或表達(dá)，或者可以將Cas9進(jìn)行重新設(shè)計(jì)使其不會(huì)引起免疫反應(yīng)或抑制免疫系統(tǒng)本身。因此，開發(fā)有效性與安全性于一體的基因編輯技術(shù)是臨床應(yīng)用的前提。

2013年，朱煥章教授課題組在上使用ZFN，成功切除了整合在基因組中的HIV-1前病毒。相關(guān)研究工作發(fā)表在了《Nucleic Acids Res》上，被《Nature Biotechnology》等雜志引用達(dá)到102次，是復(fù)旦大學(xué)2016年高被引文章之一。2017年，該技術(shù)已獲得國內(nèi)shou個(gè)基因編輯技術(shù)在疾病上應(yīng)用的授權(quán)。朱煥章教授課題組在此基礎(chǔ)上，利用反式激活因子Tat可與HIV-1調(diào)控區(qū)LTR上反式激活應(yīng)答元件TAR結(jié)合以促進(jìn)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的原理，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了以HIV-1調(diào)控區(qū)LTR為啟動(dòng)子，通過反式激活因子Tat來調(diào)控ZFN的表達(dá)載體。由于Tat蛋白是HIV*的病毒蛋白，僅在HIV-1病毒感染的細(xì)胞表達(dá)，而Tat蛋白可與調(diào)控載體ZFN 上游調(diào)控區(qū) TAR元件結(jié)合，可誘導(dǎo)ZFN表達(dá)，從而導(dǎo)致ZFN介導(dǎo)前病毒基因切除 。伴隨HIV-1前病毒的切除，Tat蛋白表達(dá)量將會(huì)減少，由此誘導(dǎo)的ZFN表達(dá)又恢復(fù)到背景水平，因而，可避免ZFN持續(xù)表達(dá)可能引起的潛在脫靶效應(yīng)或免疫反應(yīng)。將依賴Tat的ZFN表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HIV病毒感染細(xì)胞，結(jié)果顯示大約30%感染細(xì)胞中HIV前病毒被切除（圖1B）。若轉(zhuǎn)染效率為100%的話，HIV前病毒被切除效率可達(dá)60%以上。

圖 ZFN在HIV-1感染的細(xì)胞中依賴Tat誘導(dǎo)全長前病毒切除。左圖為示意圖，右圖為ZFN表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HIV病毒感染細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測(cè)切除效率。

近幾年來，朱煥章課題組在艾滋病基因治療新型策略研究方面取得了階段性進(jìn)展。利用基因編輯三大技術(shù)，除了前述靶向切除HIV前病毒外，也獲得了靶向抑制HIV或干預(yù)HIV潛伏的ZFP、TALE以及dCas9系統(tǒng)，證實(shí)了這些系統(tǒng)的有效性（Molecular Therapy, 2016, 508-521. Molecular Therapy- Nucleic Acids, 2017, 233-242）.Gene Therapy ，2014，90-95；AIDS Res Hum Retroviruses，2015，98-106）。