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電化學(xué)發(fā)光免疫測定
電化學(xué)發(fā)光免疫測定(electrochemiluminescence immunoassay，ECLl)是電化學(xué)發(fā)光(ECL)和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物。ECLI中標(biāo)記物的發(fā)光原理與一般的化學(xué)發(fā)光(CL)不同，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光2個(gè)過程。ECL與CL的差異在于ECL是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，而CL是通過化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。在電化學(xué)發(fā)光免疫測定中應(yīng)用的標(biāo)記物為電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的底物三聯(lián)吡啶釕，其衍生物N—羥基琥珀酰胺(NHS)酯可通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗原分子結(jié)合，制成標(biāo)記的抗體或抗原。ECLI的測定模式與ELISA相似，分2個(gè)步驟進(jìn)行?，F(xiàn)以雙抗體夾心法測定TSH抗原為例介紹ECLI反應(yīng)原理。
第1步：耦聯(lián)有活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即[Ru(bpy)3]2+N—羥基琥珀酰胺酯(NHS)的TSH抗體和結(jié)合了生物素的TSH抗體與待測血清同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中孵育。
第2步：將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應(yīng)杯中，再次孵育，使生物素與親和素的結(jié)合，將磁珠、TSH抗體連接為一體，形成雙抗體夾心。
第3步，蠕動(dòng)泵將形成的[Ru(bpy)3]2+抗體—抗原—抗體—磁珠復(fù)合體吸人流動(dòng)測量室，此時(shí)，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時(shí)，游離的TSH抗體（與生物素結(jié)合的和與[Ru(bpy)3] 2+結(jié)合的抗體)也被吸出測量室。
緊接著，蠕動(dòng)泵加入含三丙胺(TPA)的緩沖液，同時(shí)電極加電壓，啟動(dòng)ECL反應(yīng)過程。發(fā)光劑[Ru(bpy)3]2+和電子供體TPA在陽極表面，可同時(shí)各失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)，使2價(jià)的[Ru(bpy)3] 2+被氧化成3價(jià)，后者是一種強(qiáng)氧化劑；另一方面，TPA被氧化成陽離子自由基TPA…，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去1個(gè)質(zhì)子(H+)，形成自由基TPA·，這是一種很強(qiáng)的還原劑，可將1個(gè)電子給3價(jià)的[Ru(bpy)3)3] 2+，使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3] 2+通過熒光衰減機(jī)制，發(fā)射出一個(gè)波長620nm的光子，重新生成基態(tài)的[Ru(bpy)3] 2+。該過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強(qiáng)度，光強(qiáng)度與[Ru(bpy)3] 2+的濃度呈線性關(guān)系，故可測出待測抗原的含量。
ECLI具有以下優(yōu)點(diǎn)：①標(biāo)記物可再循環(huán)利用，使發(fā)光時(shí)間更長，強(qiáng)度更高，易于測定；②敏感度高，可達(dá)pg/ml或pmol水平；③線性范圍寬，可達(dá)>104單位；④反應(yīng)時(shí)間短，20min以內(nèi)可完成測定；⑤試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持1年以上。目前ECLI不僅可以應(yīng)用于所有的免疫測定，而且還可用于DNA／RNA探針的檢測。