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抗體的純化：鹽析法
精制抗體的方法很多。一般采用綜合技術(shù)，避免蛋白變性。如分離IgG時，多結(jié)合使用鹽析法與離子交換法，以求純化。提取IgM的方法也很多，如應(yīng)用凝膠過濾與制備電泳法，或離子交換與凝膠過濾等。
一、原理
蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。
1、試劑
（1）正常人混合血清；滅菌生理鹽水。
（2）飽和硫酸銨溶液的配制
稱（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸餾水500ml溶解，攪拌20分鐘，趁熱過濾。冷卻后以濃氨水（15N NH4OH）調(diào)PH至7.4。配制好的飽和硫酸銨，瓶底應(yīng)有結(jié)晶析出。
（3）萘氏試劑配制
稱HgI 11.5克，KI8克，加蒸餾水至50ml，攪拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。
（4）0.02M，PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制：
貯存液
A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸餾水至1000ml；
B液： 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸餾水至1000ml；
應(yīng)用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理鹽水作10倍稀釋即成。
（5）0.1M，PH7.4磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer P配制
將上述A液取81ml與B液19ml混合，再以蒸餾水對倍稀釋即成。
（6）20%磺基水楊酸。
2、器材
普通冰箱、離心機(jī)、電磁攪拌器，751桮型紫外分光光度計、扭力天平，粗天平。透析袋、尼龍繩、細(xì)竹棒、精密PH試紙（PH5.5～9.0）、眼科鑷子、小剪刀。燒杯、量筒、吸管、滴管、滅菌小瓶、試管等。
3、實(shí)驗(yàn)操作
取1X ml血清加1X ml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2X ml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀
離心（3000rpm），20min，充上清，以x ml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此時，（nh4）2so4的飽和度為33%]
重復(fù)上述第二步過程1～2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白，以0.02% mol/l pH7.4pbs溶解至x ml裝入透析袋。
↓對PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測透析外液無黃色，即無NH4+為止。
取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，以752型紫外分光光度計測定蛋白含量。
4、影響鹽析的因素
影響鹽析的因素很多，如蛋白質(zhì)的濃度，鹽的濃度，飽和度和pH，溫度等都可影響鹽析的結(jié)果，操作時要充分注意。
（1）蛋白質(zhì)的濃度
鹽析時，溶液中蛋白質(zhì)的濃度對沉淀有雙重影響，既可影響蛋白質(zhì)沉淀極限，又可影響蛋白質(zhì)的共沉作用。蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低，但雜蛋白的共沉作用也隨之增加，從而影響蛋白質(zhì)的純化。故常將血清以生理鹽水作對倍稀釋后再鹽析。
（2）離子強(qiáng)度
各種蛋白質(zhì)的沉淀要求不同的離子強(qiáng)度。例如當(dāng)硫酸銨飽和度不同，析出的成分就不同，飽和度為50％時，少量白蛋白及大多數(shù)擬球蛋白析出；飽和度為33％時γ球蛋白析出。
（3）鹽的性質(zhì)
有效的鹽是多電荷陰離子。
（4）PH值
一般說來，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，也就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。
（5）溫度
鹽析時溫度要求并不嚴(yán)格，一般可在室溫下操作。血清蛋白于25℃時較0℃更易析出。但對溫度敏感的蛋白質(zhì)，則應(yīng)于低溫下鹽析。
（6）蛋白質(zhì)沉淀后宜在4℃放3小時以上或過夜，以形成較大沉淀而易于分離。