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PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析
PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成之后，必須通過嚴(yán)格的鑒定，才能確定是否真正得到了準(zhǔn)確可靠的預(yù)期特定擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠電泳是檢測(cè)PCR產(chǎn)物常用和zui簡便的方法，能判斷產(chǎn)物的大小，有助于產(chǎn)物的鑒定。凝膠電泳常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者主要用于DNA pian段大于100bp者，后者主要用來檢測(cè)小片段DNA。
1．瓊脂糖凝膠電泳
這是實(shí)驗(yàn)室zui常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時(shí)，由于泳動(dòng)速度不同而被分離，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子發(fā)出熒光而判定其分子的大小。
用于電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖濃度常為1%—2%，應(yīng)該使用純度高的電泳純級(jí)瓊脂糖，這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質(zhì)。
（1）制膠
瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會(huì)溢出來，過厚觀察時(shí)熒光穿透不強(qiáng)以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配制2%凝膠100ml，稱取瓊脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波爐加熱2-5min，使瓊脂糖*溶解（注意不要暴沸），置室溫等溫度下降至60℃時(shí)，加入終濃度0.5μg/ml的EB液，充分混勻后倒板（注意排除氣體）。
（2）加樣和電泳
上樣時(shí)一般取PCR反應(yīng)液5~10μl，加入3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩(wěn)壓可調(diào)中壓電泳儀，電泳工作液為0.5×TBE液，接通電源，使樣品由負(fù)極向正極移動(dòng)。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。
（3）檢測(cè)
將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)，DNA產(chǎn)物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復(fù)合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現(xiàn)，并與擴(kuò)增時(shí)所設(shè)的陽性對(duì)照比較，判斷陽性或陰性結(jié)果。也可在電泳時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照，判斷其擴(kuò)增片段是否與設(shè)計(jì)的大小相一致。
2、聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣，但在引物純化、PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切限制性長度多態(tài)性分析時(shí)常用到。
它與瓊脂糖凝膠電泳比較具有如下優(yōu)點(diǎn)：
①分辨率很強(qiáng)，可達(dá)1bp；
②能裝載的DNA量大，達(dá)每孔10μgDNA；
③回收的DNA純度高；
④其銀染法的靈敏度較瓊脂糖中EB染色法高2~5倍；
⑤避免了EB迅速退色的弱點(diǎn)，銀染的凝膠干燥后可長期保存。
聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA pian段的有效范圍：
(1)制膠
在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。
制備適量合適濃度的凝膠，使之略多于膠板。制備100μl體積凝膠的配制方法見下表。
不同濃度（%）聚丙酰胺凝膠的制法：
試劑 | 3.5% | 5% | 8% | 12% | 20% |
30%丙烯酰胺溶液（ml） | 11.6 | 16.6 | 26.6 | 40 | 66.6 |
水（ml） | 67.7 | 62.7 | 26.6 | 40 | 66.6 |
5×TBE（ml） | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
10%過硫酸銨（ml） | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 |
TEMED（ml） | 0.035 | 0.035 | 0.035 | 0.035 | 0.035 |
在加入TEMED和10%過硫酸銨后，立即混勻，倒入放置45℃角的玻璃板內(nèi)，*注滿（注意不要有氣泡），迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔頂并夾緊，待30-60分鐘膠聚合后，取下膠板，放入電泳槽中固定。
（2）加樣和電泳
上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液，溢過加樣孔，拔出梳子，排出加樣孔中的氣泡，將PCR產(chǎn)物或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物2與1上樣緩沖液混勻，用微量注射器加入加樣孔底部，使樣品在孔底成一層，兩側(cè)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)分子量的DNA Marker。
以2-10V/cm電壓電泳，電泳時(shí)間足夠長，使片斷足以分開，待指示劑走到適宜位置時(shí)關(guān)閉電源，將膠片取出。
（3）銀染
分開兩塊玻璃板，將凝膠片放入100ml銀染固定液中振蕩15min，雙蒸水洗3次，每次2min，然后將凝膠片轉(zhuǎn)入100ml 0.2%的AgNO3中于搖床上染色約10min，吸去AgNO3液，用雙蒸水洗3次，每次30s，加入100ml顯色液約7-10min，待DNA帶顯示清除時(shí)，吸去顯色液，加入固定液Na2CO3，靜置2-3min，取出凝膠觀察。