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如何分辨細(xì)胞死亡類型
細(xì)胞死亡是發(fā)育、平衡和宿主防御的一個(gè)重要生物過程。在過去十年中，許多新型細(xì)胞死亡模式已被定義和表征。細(xì)胞死亡可分為調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡（Regulated cell death, RCD）和意外細(xì)胞死亡（Accidental cell death, ACD）。調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡涉及基因編碼機(jī)制，這些機(jī)制在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的觸發(fā)下，以協(xié)調(diào)的事件序列發(fā)揮作用。這些信號(hào)可以通過藥物干預(yù)進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)。生理形式的 RCD 泛指程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death, PCD）。
調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡曾是細(xì)胞凋亡的代名詞，但現(xiàn)在人們認(rèn)識(shí)到，調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡還包括許多其他新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡途徑。最近發(fā)現(xiàn)了幾種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡類型，它們具有共同的形態(tài)特征，但采用了不同的分子途徑。其中包括壞死（Necroptosis）、細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）。因?yàn)檫@些途徑在不同的觸發(fā)因素下被激活，并通過不同的生化途徑執(zhí)行，所以區(qū)分不同形式的非凋亡性細(xì)胞死亡具有挑戰(zhàn)性。
壞死
細(xì)胞壞死是由壞死體復(fù)合物的形成引起的一種細(xì)胞壞死，與細(xì)胞凋亡不同，它是一種不依賴于caspase的細(xì)胞死亡形式。細(xì)胞壞死是由上游細(xì)胞死亡受體（DRs）誘導(dǎo)的，如腫瘤壞死因子 TNF 受體 1（TNFR1）（ADI-CSA-815，EnzoLife）、CD95、TRAIL-R1 （ALX-804-912-0100，EnzoLife）和 TRAIL-R2（ALX-210-743-C200，EnzoLife）的超家族受體，它們能在配體結(jié)合后通過一個(gè)保守的細(xì)胞膜死亡結(jié)構(gòu)域傳遞細(xì)胞死亡信號(hào)。壞死的標(biāo)志是質(zhì)膜破裂并釋放促炎性損傷相關(guān)分子模式。通過化學(xué)抑制或轉(zhuǎn)基因模型來靶向壞死通路的成分，可用于確認(rèn)細(xì)胞死亡是否依賴于壞死。Necrostatin-1 (Nec1) （BML-AP309，EnzoLife）可抑制細(xì)胞壞死。病毒編碼幾種不同類型的 caspase-8 抑制劑，這表明阻止 caspase-8 依賴性細(xì)胞凋亡為病毒提供了優(yōu)勢(shì)。在這種情況下，細(xì)胞壞死似乎是限制病毒復(fù)制的后備細(xì)胞死亡過程。
細(xì)胞焦亡
細(xì)胞焦亡是一種調(diào)節(jié)性壞死細(xì)胞死亡，主要發(fā)生在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中。這種形式的RCD由炎性 caspase（即小鼠的 caspase-1 和 Caspase-11（BML-SE155-5000，EnzoLife），或人的 Caspase-4 （BML-SE176-5000，EnzoLife）和 Caspase-5（BML-SE171-5000，EnzoLife））誘導(dǎo)。caspase-1和caspase-11（或caspase-4、-5）都會(huì)通過蛋白分解處理Gasdermin D（GSDMD）產(chǎn)生一個(gè)N端片段，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，打開質(zhì)膜上的孔，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。釋放的蛋白質(zhì)包括先天性細(xì)胞因子 IL-1β 和 IL-18，它們與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)一起導(dǎo)致組織炎癥。熱蛋白沉積通常發(fā)生在微生物感染之后，其作用是啟動(dòng)免疫反應(yīng)并殺死受感染的細(xì)胞。發(fā)生熱蛋白沉積的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)與 DNA 損傷相關(guān)的核凝結(jié)、細(xì)胞腫脹，并最終在釋放 IL-1β 的同時(shí)發(fā)生細(xì)胞溶解。造成這一過程的機(jī)制涉及細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)物傳感器和炎性體的形成。炎性體基因表達(dá)的增加可能是細(xì)胞內(nèi)促炎癥反應(yīng)的跡象?？梢酝ㄟ^觀察Caspase活化、GSDMA 裂解，或通過抑制或消減細(xì)胞焦亡途徑的關(guān)鍵成分來研究細(xì)胞焦亡。可通過釋放的 LDH 定量、熒光顯微鏡觀察膜完整性的喪失以及檢測(cè) IL-1b 來評(píng)估裂解。在裂解過程中，活性 Caspase會(huì)從其無活性的Caspase前體形式中裂解出來。使用特異性caspase抗體可通過 Western Blot檢測(cè)Caspase的裂解。證明Caspase 1、11、4 或 5 的依賴對(duì)于區(qū)分細(xì)胞焦亡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與其他形式的壞死和凋亡至關(guān)重要。使用Pan Caspase抑制劑Z-VAD-FMK（ALX-260-020，EnzoLife）進(jìn)行化學(xué)抑制，可以消除Caspase 1的活性。
鐵死亡
鐵死亡是一種受調(diào)控的細(xì)胞死亡形式，是鐵依賴性活性氧（ROS）積累導(dǎo)致的致命脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的結(jié)果。有多種方法可用于檢測(cè) ROS（ENZ-51011，EnzoLife） 的存在。鐵死亡的細(xì)胞通常表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）是一種能還原過氧化氫、有機(jī)氫過氧化物和過氧化脂質(zhì)的酶，它的喪失或活性降低也會(huì)引發(fā)鐵死亡。在GPX4缺乏的情況下，脂質(zhì)過氧化會(huì)通過脂質(zhì)自由基（脂質(zhì)過氧自由基）的積累而失控。脂質(zhì)過氧化改變了脂質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，降低了它們形成功能性細(xì)胞膜的能力，因此會(huì)導(dǎo)致膜完整性喪失和細(xì)胞死亡。脂質(zhì)烷氧基自由基的碎裂還會(huì)產(chǎn)生丙二醛4-羥基壬烯醛4-hydroxynonenal (4-HNE)（BML-HA004，EnzoLife）等活性醛。通過鐵螯合劑、親油抗氧化劑、脂質(zhì)過氧化抑制劑和多不飽和脂肪酸的消耗，可抑制細(xì)胞的鐵死亡，這與脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物的積累有關(guān)。通過觀察抑制劑是否能阻止細(xì)胞死亡以及測(cè)量脂質(zhì)過氧化物lipid peroxides（BML-AK171，EnzoLife），可以確認(rèn)是否存在鐵死亡。研究鐵死亡的有效方法包括測(cè)量谷胱甘肽過氧化物酶的活性。
圖 1：用 100 μM 的焦花青素（一般 ROS 誘導(dǎo)劑，A 組）或 1 μM 的叔丁基過氧化氫（過氧化物誘導(dǎo)劑，B 組）誘導(dǎo) Jurkat 細(xì)胞，用ROS-ID® Total ROS Detection Kit（ENZ-51011，EnzoLife）染色，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照。
| 細(xì)胞死亡類型 | 關(guān)鍵分子 | 關(guān)鍵形態(tài) | 檢測(cè)方法 |
| 壞死 | 無 | 細(xì)胞腫脹；膜破裂；細(xì)胞器喪失 | LDH activity assay; Loss of membrane integrity; cell impermeable DNA binding Dye |
| 細(xì)胞凋亡 | Caspases, Bcl-2 | 質(zhì)膜出血；細(xì)胞和核體積縮小及核破碎 | Apoptosis detection kit |
| 壞死性凋亡 | DRs, TLRs, DNA 和 IL-6 | 質(zhì)膜破裂；細(xì)胞器腫脹；染色質(zhì)適度凝結(jié) | Apoptosis/Necrosis Detection kit |
| 細(xì)胞焦亡 | Caspase-1, IL-1Β,IL-18 | 細(xì)胞腫脹、DNA 濃縮和破碎 | Quantification of LDH, Caspase-1 Fluorogenic Assay Kit for Drug Discovery |
| 鐵死亡 | 鐵積累、脂質(zhì)過氧化和 ROS 生成增加 | 線粒體小，膜破裂 | ROS quantification, Malonaldehyde quantification, 4-HNE quantification |
文中部分相關(guān)產(chǎn)品：
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品名 | 相關(guān)應(yīng)用 | 規(guī)格 |
| ENZ-51011 | ROS-ID® Total ROS detection kit | 直接監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中活性氧 (ROS) 的總體水平，但不包括超氧化物。與組織培養(yǎng)基的主要成分（酚紅、FBS 和 BSA）兼容。 | 1 Kit |
| ENZ-51002-25 | GFP-CERTIFIED® Apoptosis/Necrosis detection kit | 多重檢測(cè)，可區(qū)分健康細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，與 GFP 和其他熒光探針（藍(lán)色或青色）兼容。 | 25 assays |
| ENZ-51002-100 | 100 assays | ||
| ENZ-KIT157-2500 | LDH Cytotoxicity WST Assay | 通過測(cè)量乳酸脫氫酶活性測(cè)定細(xì)胞毒性的比色試劑盒。 | 5x500 tests |
| ENZ-KIT157-0500 | 500 tests | ||
| BML-HA004-0010 | (±)4-Hydroxynon-2-enal | 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。 | 10 mg |
| BML-HA004-0001 | 1 mg | ||
| BML-AK171-0001 | ALDetect™ (MDA-specific) Lipid Peroxidation assay kit | 用于檢測(cè)游離 MDA 或水解步驟后的總 MDA（即游離和蛋白結(jié)合的希夫堿共軛物）。檢測(cè)條件可最大限度地減少其他脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（如 4-羥基烯烴）的干擾。 | 25 tests |
| BML-AK701-0001 | Caspase-1 assay kit for drug discovery | 用于檢測(cè)重組 caspase-1 的蛋白酶活性。可在 405 nm波長(zhǎng)下用比色法或熒光法監(jiān)測(cè)四肽底物的裂解。 | 96 wells |
| BML-AP400-0001 | 7-Aminoactinomycin D | DNA結(jié)合染料，可用于流式細(xì)胞儀識(shí)別凋亡細(xì)胞。DNA-primed RNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑。 | 1 mg |
| ADI-900-158 | Glutathione peroxidase activity kit | 可在 30 分鐘內(nèi)對(duì)各種樣品基質(zhì)中的谷胱甘肽過氧化物酶活性進(jìn)行高通量分析。 | 5x96 wells |
| BML-AP309-0100 | Necrostatin-1 | 細(xì)胞程序性壞死抑制劑。該抑制劑可抑制 TNFα 處理的 Jurkat 細(xì)胞線粒體膜電位的喪失（EC50=490 nM）。不抑制 FAS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，也不影響細(xì)胞凋亡的形態(tài)。 | 100 mg |
| BML-AP309-0020 | 20 mg | ||
| ALX-260-020-M005 | Z-VAD-FMK | 廣泛的Caspase 抑制劑。Z-VAD-FMK 是一種有效的不可逆 Caspase 抑制劑，沒有細(xì)胞毒性。 | 5 mg |
| ALX-260-020-M001 | 1 mg | ||
| BML-SE155-5000 | Caspase-11 (mouse), (recombinant) | 蛋白 | 5000 U |
| BML-SE176-5000 | Caspase-4 (human), (recombinant) | 蛋白 | 5000 U |
| BML-SE171-5000 | Caspase-5 (human), (recombinant) | 蛋白 | 5000 U |
| BML-SA225-0100 | TRAIL-R1 polyclonal antibody | WB | 100 µg |
| ALX-804-297F-T100 | TRAIL-R1 (human) monoclonal antibody (HS101) (FITC conjugate) | Flow Cytometry, ICC | 100 tests |
| ALX-522-002-C050 | Fas (human): Fc (human), (recombinant) | 蛋白、ELISA | 50 µg |
| ALX-805-038-C100 | Fas (human) monoclonal antibody (2R2) | Flow Cytometry, 功能應(yīng)用（誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡--無需交聯(lián)）?？捎糜?DISC（死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體檢測(cè)）： 在受體激活后與 FADD 和 caspase-8 共免疫沉淀，。 | 100 µg |
| ADI-CSA-815-F | TNF receptor 1 polyclonal antibody | IHC-P, IP, WB | 200 µg |
| ADI-CSA-815-D | 50 µg | ||
| ALX-804-200-C100 | TNF-R1 (human) monoclonal antibody (H398) | IHC-Fr；Flow Cytometry。功能性應(yīng)用：阻斷 TNF-R 信號(hào)傳導(dǎo)。10µg/ml H398 可中和 TNF 誘導(dǎo)的 U937 細(xì)胞毒性（100%）。此外，10µg/ml H398 還能中和 TNF 誘導(dǎo)的 K562、Colo 205 和 YT 細(xì)胞的 MHC 表達(dá)（始終為 100%）。H398 可抑制/中和 TNF 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性對(duì) MCF-7、HeLa 和 L929 的影響。 | 100 µg |
| ENZ-ABS711-0100 | Fas (human) monoclonal antibody (4C3) | WB | 100 µg |
| ENZ-ABS712-0100 | Fas (human) monoclonal antibody (4G10) | ELISA, Flow Cytometry | 100 µg |
| ENZ-ABS713-0100 | Fas (human) monoclonal antibody (5H5) | ELISA, Flow Cytometry | 100 µg |
關(guān)于Enzo Life
Enzo Life做為分子診斷領(lǐng)域的先驅(qū)者，可提供包括基因、蛋白、細(xì)胞、組織全層面的標(biāo)記和檢測(cè)試劑，如原位雜交探針、活細(xì)胞熒光探針、組化試劑盒、小分子化學(xué)文庫(kù)等。除了科研領(lǐng)域外，Enzo Life還給提供多樣的生物工藝質(zhì)量檢測(cè)試劑盒（如Protein A殘留檢測(cè)盒，HCP殘留檢測(cè)等 ）
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