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背景：近年來，人們對外泌體和其他細胞外囊泡（ev）所攜帶的RNA和其他分子的重要性越來越感興趣。因為在很多應用中，尤其是在外泌體作為診斷性生物標志物和治療性載體的臨床應用已經在逐漸發(fā)揮作用。關于外泌體的純化及應用，小優(yōu)之前就做過專題的系列軟文及講座，劃到最底端可以回顧哦~

即使外泌體純化的方法多種多樣，但不同的樣本以及不同的應用情況下，大家在選擇純化方式時，依然會有選擇恐懼癥。今天小優(yōu)帶大家針對外泌體內RNA分子研究的整套流程，進行一個梳理，有幫助的情況下請“一鍵三連"哦~

Tip1：對于從EVs中特異性分析RNA，必須通過過濾或離心去除殘留的細胞、細胞片段和凋亡小體。否則，殘留的細胞RNA數(shù)量遠遠超過游離RNA，對分析造成巨大的難度，即使是少量的細胞碎片也可以對無細胞液體的RNA譜產生非常顯著的影響。

（1）在獲取血清血漿樣本時，首*行低速離心去除血細胞。采血后越早去除細胞材料，在體外產生的血細胞來源的囊泡的額外背景的風險就越低。

（2）對于所有其他生物液體（包含細胞上清），必須進行高重力離心步驟或過濾，以去除所有剩余的細胞、細胞碎片、凋亡小體等。這會顯著減少細胞或基因組DNA和RNA的含量。

推薦使用0.8 μm過濾器孔徑（或3000xg離心）將有效地排除細胞物質，包括血小板碎片，但仍保留絕大多數(shù)EVs，而使用0.2或0.45 μm過濾器（或離心，例如16000xg）將去除一些較大的囊泡。

Tip2：針對尿液等樣本，富含干擾成分，可進行長短RNA的分離；并建議使用晨尿樣本

尿液中可能含有各種代謝物，它們可能會干擾RNA分析，例如，使用RT-PCR或RNA-Seq。為了確保分離的RNA的最佳性能，我們建議分別分離長RNA和短RNA物種（分別大于或小于約200nt）。對于短RNA的分離，使用Reagent UI（cat:77900，QIAGEN）。

Tip3：膜親和法純化EVs，其整體表達譜更完整，且操作簡單，便于下游RNA的一步分離

QIAGEN exoEasy 系列試劑盒使用基于膜的親和結合步驟從無細胞生物液體中分離出外泌體和其他ev。該方法不根據(jù)大小或細胞來源來區(qū)分ev，也不依賴于特定表位的存在。而是利用囊泡的一般生化特征來進行外泌體的純化，下游可進行粒徑分析、WB、電鏡、及RNA分析等。初次之外，升級的exoRNeasy系列可直接進行樣本中外泌體RNA的純化，減少移液步驟，得率更高。1h內即可完成純化哦~

圖注：The exoRNeasy Midi/Maxi Kit 純化外泌體和總RNA分離在不到1小時內

Tip 4：miRNA純化后定量，使用qRT-PCR結果更精準

常規(guī)的RNA濃度使用分光光度計測量260 nm（A260）處的吸光度來確定。然而，對于從EVs中獲得的少量RNA，可能很難用光度法確定其數(shù)量。少量的RNA可以使用安捷倫®2100生物分析儀、定量RT-PCR或熒光定量法進行定量。當從特別小的樣本（如激光顯微解剖樣本，或血漿或血清）中純化RNA時，應使用qRT-PCR進行定量。RIN值通常也不能作為EVs（或總血漿或血清）中細胞游離RNA的RNA完整性的指標。

Tip 5：EVs（或總血漿或血清）中，內參需謹慎選擇，或使用外參作為對照

在進行細胞、血液、組織microRNA檢測時，我們常用選擇U6做內參基因。不過在EVs中miRNA的內參，大家各有己見。除各自行摸索的內參外，選擇添加外參也是一種常見的形式，其中cel-miR-39-3p被廣泛的應用，將此RNA加入到樣本中，進行共同純化，可以檢測提取、PCR等過程。
RNA Spike-In Kit, For RT（cat:339390，QIAGEN）是最新推出的一個參照試劑盒，其中包含兩個部分：Box1：提前預混的UniSp2、 UniSp4 和 UniSp5，主要用于RNA純化的對照。Box2：cel-miR-39-3p，用于cDNA合成對照。以上試劑盒兼容SYBR GREEN和probe方法的qPCR。

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